Onco-Immune PPI筛选与LKB1-cIAP1互作验证
发现LKB1与免疫调控蛋白的相互作用并验证cIAP1结合的结构基础
构建85个免疫调控基因文库，用BRETn技术进行PPI映射；通过GST pulldown、co-IP、域截断和TR-FRET验证LKB1-cIAP1互作及结构域
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揭示重连的IAP-JAK调控轴作为LKB1突变肺癌的免疫依赖性脆弱点
Uncovering the rewired IAP-JAK regulatory axis as an immune-dependent vulnerability of LKB1-mutant lung cancer.
实验完整度
高体外细胞模型、免疫共培养、小鼠同种移植模型及患者样本数据，含功能验证和机制验证
主要模型
LKB1突变人肺癌细胞系（A549、H1755、H1299、H1792等） 人PBMC与肺癌细胞共培养体系 LKB1突变小鼠肺癌细胞系WRJ388同种移植免疫活性小鼠模型 CMT167 LKB1-KO小鼠肺癌细胞系同种移植C57BL/6J小鼠模型
重点核对
LKB1突变状态：使用LKB1-WT与LKB1-KD/MUT等基因对细胞系及患者来源细胞 IAP抑制剂处理浓度：birinapant 50-500 nM，其他IAPi 500 nM IFNγ处理浓度与时间：1 ng/mL处理24 h 共培养免疫细胞比例与来源：PBMC、CD8+ T细胞、CD56+ NK细胞，剂量依赖性共培养4天 体内birinapant给药方案：10 mg/kg腹腔注射，每3天一次
摘要
利用免疫系统的力量治疗癌症已成为核心临床方法。然而，基因组改变引起的内在回路重连使肿瘤细胞能够逃避免疫监视，导致治疗失败。揭示肿瘤突变如何诱导治疗抵抗的分子基础可能指导干预方法的开发，以推进精准免疫治疗。在此，我们报道了肝激酶B1（LKB1）-凋亡抑制蛋白（IAP）-Janus激酶1（JAK1）动态复合物作为LKB1突变肺癌细胞免疫反应的分子决定因素的鉴定。LKB1改变暴露了肺癌细胞对IAP的免疫抵抗关键依赖性。实际上，IAP的药理抑制重新建立了JAK1调控的干扰素基因刺激因子（STING）表达和DNA感知信号，增强了细胞毒性免疫细胞浸润，并在LKB1突变免疫活性小鼠模型中增强了免疫依赖性抗肿瘤活性。因此，靶向IAP-JAK1的策略，如IAP抑制剂，可能提供一种有前景的治疗方法，以恢复免疫冷LKB1突变肿瘤对免疫检查点抑制剂或STING导向疗法的反应性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LKB1突变如何通过肿瘤内在蛋白相互作用网络导致肺癌免疫抑制和对免疫治疗的原发性抵抗？
- 核心机制
- LKB1突变使cIAP1从LKB1结合中释放，转而结合JAK1并促进其降解，抑制IFNγ-JAK-STAT信号，导致STING表达下调和DNA感知信号受损；IAP抑制剂可破坏cIAP1-JAK1互作，恢复JAK1-STING通路。
- 主要证据
- Onco-Immune PPI筛选和生化验证发现LKB1-cIAP1-JAK1复合物；IAP抑制剂在PBMC共培养中选择性增强LKB1突变细胞杀伤；STING敲低/过表达及JAK1/STAT1敲低验证通路依赖性；WRJ388同种移植模型中birinapant显示免疫依赖性抗肿瘤活性并增加CD8+ T细胞浸润。
- 研究意义
- 提示IAP-JAK1靶向策略（如IAP抑制剂）可能恢复免疫冷LKB1突变肿瘤对免疫检查点抑制剂或STING导向疗法的反应性，为精准免疫治疗提供潜在干预方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HTiP筛选IAP抑制剂作为免疫增敏剂
鉴定能恢复LKB1突变细胞对免疫杀伤敏感性的化合物
用2036化合物库在H1755细胞与PBMC共培养体系中进行HTiP筛选，验证IAP抑制剂选择性杀伤
IAP抑制剂与IFNγ协同诱导STING表达及信号
验证IAP抑制通过JAK-STAT通路恢复STING表达和DNA感知信号
用IAP抑制剂单独或联合IFNγ处理LKB1突变细胞，检测STING mRNA/蛋白、TBK1/IRF3磷酸化及下游基因；用JAK抑制剂、STING抑制剂和基因敲低验证依赖性
STING介导的细胞凋亡和免疫细胞趋化体外验证
评估IAP抑制剂诱导STING活化后的功能后果
用caspase3/7活化检测凋亡，用transwell实验检测Jurkat T细胞和NK92-MI细胞迁移
LKB1突变小鼠同种移植模型体内验证
在免疫活性小鼠中验证IAP抑制剂的免疫依赖性抗肿瘤活性及机制
将WRJ388细胞皮下接种至免疫活性KL小鼠和裸鼠，给予birinapant治疗，检测肿瘤体积、CD8+ T细胞浸润和STING表达
IAP抑制剂与anti-PD1联合治疗评估
测试IAP抑制剂能否增强免疫检查点抑制剂对LKB1-KO肿瘤的疗效
用CMT167 LKB1-KO细胞在C57BL/6J小鼠中建立移植瘤模型，给予AT406和/或anti-PD1治疗，并通过CD8+/CD4+ T细胞清除验证依赖性
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质相互作用检测
化合物筛选与细胞活力检测
基因表达与信号通路检测
免疫细胞功能与浸润评估
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | ATLANTA biologicals | S11550 | |
| 青霉素/链霉素 | Cell Gro | 30-002-CI | |
| 支原体检测 | 支原体检测试剂盒 | InvivoGen | rep-mysnc-100 |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | -- | 23966 |
| FuGene HD转染试剂 | Roche | E2920 | |
| BRETn检测 | Nano-Glo®荧光素酶底物furimazine | Promega | N1120 |
| 细胞活力检测 | Cell Titer Blue试剂 | Promega | G8081 |
| qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Omega | R6834-01 |
| SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green预混液 | Bio-rad | 1725272 | |
| 细胞质dsDNA分离 | 线粒体DNA分离试剂盒 | BioVision | K280-50 |
| QIAamp DNA迷你试剂盒 | QIAGEN | 51304 | |
| 免疫共沉淀 | EZview Red Anti-Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | F2426 |
| EZview Red Anti-HA亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| GST pulldown | 谷胱甘肽偶联琼脂糖珠 | GE | 17-0756-05 |
| Western blot | SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo | 34580 |
| Dura长效底物 | Thermo | 34076 | |
| Flag-HRP抗体 | Sigma | A8592 | |
| GST-HRP抗体 | Sigma | A7340 | |
| STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 磷酸化TBK1(S172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 磷酸化IRF3(S386)抗体 | Abcam | 76493 | |
| LKB1抗体 | Invitrogen | AHO1392 | |
| JAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 50996S | |
| cIAP1抗体 | Cell Signaling Technology | 7065 | |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 | |
| TR-FRET | 抗GST铽抗体 | Cisbio US Inc | 61GSTTLB |
| 荧光素酶报告基因检测 | Dual-Glo荧光素酶试剂盒 | Promega | E2920 |
| STING-HiBiT检测 | Nano-Glo® HiBiT裂解检测系统 | Promega | -- |
| 凋亡检测 | Incucyte® Caspase-3/7绿色染料 | SARTORIUS | 4440 |
| Transwell迁移实验 | CellTracker™ Green CMFDA染料 | ThermoFisher | C2925 |
| cGAMP ELISA | 2’,3’-cGAMP ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | 501700 |
| 动物实验 | birinapant | -- | -- |
| Captisol | MedChemExpress | -- | |
| 抗PD1抗体 | BioXcell | -- | |
| 抗小鼠CD8a抗体 | Bioxcell | BE0061 | |
| 单细胞质谱流式 | Maxpar®小鼠脾/淋巴结表型分析面板试剂盒 | Fluidigm | 201306 |
| 免疫组化 | CD8抗体 | Abcam | ab237723 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LKB1突变细胞系模型建立 | LKB1突变状态（LKB1-WT vs LKB1-KD/MUT）及细胞系来源（A549、H1755等） 阅读提示：Methods中 In vitro cell culture 小节及Results中相关描述 |
| IAP抑制剂处理 | birinapant浓度（50-500 nM）、处理时间（24-72 h）及其他IAPi浓度（500 nM） 阅读提示：Figure legends 2C-2G、3C-3H、5A-5D 及 Methods 中相关描述 |
| 免疫细胞共培养 | PBMC/CD8+ T/CD56+ NK细胞来源、效靶比、共培养时间（4天）及活化条件（CD3抗体100 ng/mL、IL-2 10 ng/mL） 阅读提示：Methods中 Immune and tumor cell co-culture assay 小节 |
| 体内同种移植模型 | WRJ388细胞接种量（2×10^6）、birinapant剂量（10 mg/kg，每3天一次）、给药途径（腹腔注射）及对照（vehicle） 阅读提示：Methods中 Animal studies 小节及 Figure 6A |
| STING/JAK通路依赖性验证 | STING抑制剂H151浓度（5 μM）、JAK抑制剂ocla/tofa浓度（10 μM）、IFNγ浓度（1 ng/mL）及处理时间（24 h） 阅读提示：Figure legends 2H、3J-3O、4I-4L 及 Methods 中相关描述 |