微波兼容的凝胶化学与锚定策略开发
建立可微波加速的凝胶化和锚定条件，以实现快速扩张。
测试丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶配方，优化AA和bis浓度；验证甲基丙烯酸酯-琥珀酰亚胺酯（AcX）锚定在微波下的效果，并最终采用30% AA+4% PFA锚定策略；通过碱性水解将酰胺基团转化为羧基。
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BOOST：一种在小时尺度上稳健的十倍扩张方法
BOOST: a robust ten-fold expansion method on hour-scale.
实验完整度
高包含培养细胞、组织切片、FFPE、类器官和淋巴结等多模型，并进行形态、免疫和扩张因子验证。
主要模型
U2-OS培养细胞 小鼠组织切片（脑、肝、肾等） 小鼠和人类FFPE切片 气道类器官和完整淋巴结
重点核对
微波辅助凝胶化与水解的化学条件（AA/bis浓度、pH、时间） 锚定策略验证（30% AA+4% PFA vs AcX） 扩张因子和凝胶机械性能（变形指数） 免疫染色后抗体特异性和扩张保真度（测量误差） FFPE样本抗原修复步骤的必要性
摘要
扩张显微镜通过物理扩张生物标本提高显微镜分辨率，并改善结构和分子细节的可视化。过去十年中，为满足特定研究需求，已开发出众多扩张显微镜技术和标记方法。然而，当前方案的一个共同限制是样本处理时间过长，尤其是对于难以扩张的生物标本（例如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片和大型三维标本）。在此，我们提出BOOST，一种快速且稳健的扩张显微镜工作流程，利用一系列微波加速的扩张显微镜化学。具体而言，BOOST能够在90分钟内对培养细胞、组织切片甚至难以扩张的FFPE切片实现单步10倍扩张。值得注意的是，BOOST开创了大型毫米级三维标本的10倍扩张，据我们所知此前无法实现。该工作流程基于稳定且常见的试剂，易于调整，从而提升了扩张显微镜在应用中的采用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过微波兼容化学将扩张显微镜的样本处理时间从数天缩短至小时级，并实现包括FFPE和大型三维标本在内的多种样本的稳健十倍扩张？
- 核心机制
- BOOST利用微波照射加速单体浸润、锚定、凝胶化、变性和水解等步骤；采用不含丙烯酸钠的丙烯酰胺/双丙烯酰胺凝胶配方，通过碱性水解使凝胶可膨胀，并利用PFA/AA锚定化学将生物分子共价连接到水凝胶。
- 主要证据
- 在培养细胞（U2-OS）、小鼠组织切片、小鼠和人类FFPE切片、类器官及完整淋巴结中实现了约10倍扩张；扩张保真度通过微管和NPC尺寸测量验证，畸变低于3%；FFPE样本处理时间缩短至4小时以内。
- 研究意义
- BOOST显著提高了扩张显微镜的通量，并使得时间敏感的应用（如纳米病理学）成为可能；其使用常见试剂和仪器，易于推广。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
培养细胞和组织切片的BOOST扩张与形态学验证
验证BOOST在培养细胞和薄组织切片中实现10倍扩张并保留超微结构。
对U2-OS细胞和小鼠组织切片进行锚定、凝胶化、变性水解和扩张；使用NHS酯和SYTOX Green染色，显微镜观察线粒体、突触、核孔等结构。
FFPE样本的BOOST扩张
验证BOOST对高度交联的FFPE切片实现快速10倍扩张。
对小鼠肺肿瘤和人类前列腺癌FFPE切片进行脱蜡、微波抗原修复（Tris-EDTA pH 9，30分钟）、锚定、凝胶化、变性和扩张；NHS酯染色观察肿瘤形态和线粒体。
微波加速免疫染色及扩张保真度评估
验证BOOST扩张后免疫染色兼容性及扩张引起的畸变程度。
对扩张后的细胞、组织切片和FFPE切片进行微波辅助免疫染色（α-tubulin、NUP153/96、keratin、CAV1等）；比较扩张前后图像，计算测量误差和畸变。
大型三维标本（类器官和淋巴结）的10倍扩张
验证BOOST对毫米级三维标本实现均匀10倍扩张。
对约500 µm气道类器官和毫米级完整淋巴结进行锚定、凝胶化、变性水解和扩张；使用NHS酯和SYTOX Green染色，3D成像观察整体形态和超微结构。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 变性 | 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 |
| 硼酸 | 3A | A01298 | |
| 染色 | ATTO 488 NHS酯 | ATTO-TEC | -- |
| ATTO 565 NHS酯 | ATTO-TEC | -- | |
| ATTO 647N NHS酯 | ATTO-TEC | -- | |
| SYTOX Green核酸染料 | Thermo Fisher | S7020 | |
| 免疫染色 | 兔多克隆抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP |
| 兔多克隆抗NUP98-NUP96抗体 | Proteintech | 12329-1-AP | |
| 兔多克隆抗NUP153抗体 | Proteintech | 14189-1-AP | |
| 兔多克隆抗PSMA/GCPII抗体 | Proteintech | 13163-1-AP | |
| 兔单克隆抗βIV微管蛋白抗体 | Abcam | EPR16776 | |
| 兔多克隆抗突触素抗体 | Proteintech | 17785-1-AP | |
| 兔多克隆抗ATPIF1抗体 | Proteintech | 12067-1-AP | |
| 兔多克隆抗波形蛋白抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| 兔多克隆泛角蛋白抗体 | Proteintech | 26411-1-AP | |
| 兔单克隆抗小窝蛋白-1 (D46G3) XP抗体 | Cell Signaling Technology | 3267S | |
| Alexa Fluor 647标记驴抗兔IgG | Abcam | ab150063 | |
| Alexa Fluor 568标记驴抗兔IgG | Abcam | ab175470 | |
| 微波处理 | PELCO BioWave® Pro+微波处理系统 | TED PELLA | 36700 |
| 组织切片 | easiSlicer振动切片机 | TED PELLA | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| FFPE预处理 | 二甲苯 | DUKSAN | UN1307 |
| 无水乙醇 | Scharlau | UN1170 | |
| 免疫染色 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| 牛血清白蛋白 | ENERGY | 9998S | |
| 凝胶 | 丙烯酸钠 | Sigma-Aldrich | 408220 |
| 4-羟基TEMPO | Energy | E020145 | |
| 细胞培养 | 多聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma-Aldrich | P8920 |
| 凝胶 | Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 |
| 染色 | DAPI | Thermo Fisher | 62248 |
| 缓冲液 | 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10010023 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 微波辅助凝胶化 | AA和bis浓度（15% w/v AA/0.005% w/v bis或17.5% w/v AA/0.0075% w/v bis）、微波时间（10-30分钟）、真空环境 阅读提示：Methods中'BOOST monomer infiltration, anchoring, and gelation'小节及Supplementary Table 1 |
| 锚定 | 锚定溶液组成（含4% PFA和AA）、微波时间（5-30分钟）、真空环境 阅读提示：Methods中'BOOST monomer infiltration, anchoring, and gelation'小节及Supplementary Table 1 |
| 变性/水解 | 变性缓冲液（10% w/v SDS，0.05 M硼酸，pH 12）、微波时间（20-60分钟） 阅读提示：Methods中'BOOST denaturation and hydrolysis conversion'小节及Supplementary Table 1 |
| FFPE抗原修复 | 抗原修复缓冲液（Tris-EDTA pH 9）、微波时间30分钟 阅读提示：Methods中'FFPE sample preparation'小节及Supplementary Table 1 |
| 免疫染色 | 一抗稀释比例（1:100）、二抗稀释比例（1:150）、微波时间（10分钟）、封闭条件 阅读提示：Methods中'BOOST immunostaining after hydrolysis and denaturation'小节及Supplementary Table 1 |