Tmie-/-小鼠SGN转录组分析
全面了解毛细胞MET缺失相关的SGN转录变化
对P21雄性Tmie-/-和Tmie+/-对照小鼠内耳细胞进行scRNA-seq，鉴定SGN并分析差异表达基因和GO富集，用FISH验证关键基因表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
毛细胞缺陷破坏听觉外周环路发育
Defects in hair cells disrupt the development of auditory peripheral circuitry.
实验完整度
高包含scRNA-seq、多种基因敲除小鼠模型、免疫荧光、电生理、ABR及AAV基因治疗功能验证
主要模型
Tmie-/-小鼠（DFNB6模型） Gfi1-GCE;TmieFL/FL条件敲除小鼠 Pcdh15av-3J/av-3J小鼠（USH1F模型） Clrn2-/-小鼠（DFNB117模型）
重点核对
Tmie-/-小鼠在P21进行scRNA-seq，比较3只KO与4只对照的雄性小鼠，仅使用雄性 AAV9.hSyn.EGFP在P3注射入半规管，P11或P21分析SGN投射 NGFR免疫荧光染色在P11和P20-23定量IHC附近末端和OHC分支 CTBP2和GLUR2免疫荧光在P14和P20-23定量突触 puncta 及共定位 AAV.PHP.eB.TMIE::EGFP在P1注射，P21记录ABR评估听力恢复
摘要
耳聋是人类最常见的感觉障碍，常由内耳毛细胞缺陷引起。在此，我们证明在模拟隐性非综合征性耳聋（DFNB6）的雄性小鼠中，毛细胞中Tmie的失活破坏了支配毛细胞的神经元的基因表达。这包括调控轴突寻路和突触发生的基因，而这两个过程在突变小鼠内耳中均被破坏。在其他基因突变导致耳聋（这些基因主要在毛细胞中发挥功能）的小鼠模型中，也观察到类似的缺陷。针对毛细胞的基因治疗恢复了DFNB6模型小鼠的听力和内耳环路。我们得出结论：毛细胞功能对于外周听觉环路的建立至关重要。因此，即使主要缺陷发生在毛细胞，耳聋的治疗模式也需要考虑恢复毛细胞和神经元二者的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 毛细胞功能缺陷在发育阶段在多大程度上影响螺旋神经节神经元分化和外周听觉环路的形成？
- 核心机制
- 毛细胞中Tmie失活（以及Pcdh15或Clrn2突变）破坏毛细胞机械转导功能，进而改变支配神经元的基因表达，包括轴突寻路和突触发生相关基因，导致SGN投射和突触成熟缺陷；谷氨酸释放缺陷不能完全解释这些表型，提示毛细胞还提供其他信号。
- 主要证据
- 在Tmie-/-小鼠中，scRNA-seq显示I型SGN转录组改变，FISH验证Kcnip3、Marcksl1、Rxrg表达变化；AAV稀疏标记和NGFR染色显示SGN外周投射异常和突触蛋白CTBP2/GLUR2减少；条件敲除小鼠重现表型；USH1F和DFNB117模型显示类似但程度较轻的缺陷；AAV介导的TMIE表达恢复听力和SGN投射。
- 研究意义
- 研究结果表明毛细胞功能对听觉外周环路的建立至关重要，提示耳聋的基因治疗等治疗模式需要考虑同时恢复毛细胞和神经元的功能，即使原发缺陷仅存在于毛细胞。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
I型SGN亚型成熟分析
确定Tmie缺失对I型SGN亚型特化的影响
使用scANVI对scRNA-seq数据中的I型SGN进行亚型注释，比较Tmie-/-与对照的亚型组成和亚型特异性基因表达。
SGN外周投射模式分析
验证Tmie缺失是否导致SGN轴突寻路和投射异常
将AAV9.hSyn.EGFP注射到P3小鼠半规管，在P11和P21通过全耳蜗铺片荧光显微镜分析SGN投射形态。
NGFR+ SGN投射和II型SGN分支分析
独立验证SGN投射缺陷并分析II型SGN形态
对P11和P20-23的Tmie-/-和对照小鼠耳蜗铺片进行NGFR免疫染色，定量IHC附近NGFR+末端和OHC区域分支。
突触连接分析
确定Tmie缺失是否影响IHC和OHC与SGN之间的带状突触形成和成熟
对P14和P21小鼠耳蜗铺片进行CTBP2和GLUR2免疫染色，定量突触前和突触后 puncta 数量及共定位。
毛细胞条件敲除验证
确定毛细胞中Tmie缺失是否足以导致SGN缺陷
使用Gfi1-GCE;TmieFL/FL小鼠在P0和P1注射他莫昔芬诱导毛细胞特异性敲除，P21进行ABR和SGN形态分析。
USH1F和DFNB117模型分析
检验其他毛细胞缺陷基因突变是否导致类似SGN缺陷
对Pcdh15av-3J/av-3J（USH1F）和Clrn2-/-（DFNB117）小鼠在P21进行NGFR和突触蛋白免疫染色，定量SGN投射和突触。
Vglut3-/-小鼠分析
检验谷氨酸释放缺陷是否足以解释SGN投射缺陷
对Vglut3-/-小鼠在P21进行NGFR染色和AAV9.hSyn.mCherry稀疏标记，分析SGN投射形态和突触。
AAV介导的基因治疗 rescue
确定恢复毛细胞TMIE表达能否挽救听力和SGN缺陷
在P1向Tmie-/-小鼠半规管注射AAV.PHP.eB.TMIE::EGFP或对照AAV.PHP.eB.EGFP，P21记录ABR并分析SGN投射和突触。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | IV型胶原酶 | ThermoFisher | 17104-019 |
| 木瓜蛋白酶 | Worthington | LK003150 | |
| DNA酶I | StemCell Technologies | 7900 | |
| RNA酶抑制剂 | Lucigen | 30281-1 | |
| 3’ v3.1凝胶珠 | 10X Genomics | PN-1000121 | |
| MyOne SILANE磁珠 | Invitrogen | 37002D | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23317 | |
| AAV注射 | AAV9.hSyn.EGFP病毒 | Addgene | #50465 |
| AAV9.hSyn.mCherry病毒 | Addgene | #114472 | |
| 固绿染料 | Thermo Scientific | A1650.22 | |
| Nanoject II显微注射器 | Drummond | DRM3-000-204 | |
| VetBond组织粘合剂 | 3M | 1469SB | |
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648-1G |
| 玉米油 | Sigma | C8267 | |
| AAV rescue | AAV.PHP.eB.CAG.EGFP对照病毒 | SignaGen | SL116010 |
| 免疫组织化学 | 兔抗NGFR抗体 | -- | -- |
| 兔抗RFP抗体 | Abcam | ab62341 | |
| 山羊抗mCherry抗体 | SicGen | AB0040-200 | |
| 小鼠抗PV抗体 | Swant | PV235 | |
| 兔抗MYO7A抗体 | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| 兔抗CALB1抗体 | Cell Signaling Technology | 13176 | |
| 小鼠抗CALB2抗体 | Millipore | MAB1568 | |
| 小鼠抗GLUR2抗体 | Millipore | MAB397 | |
| 兔抗CTBP2抗体 | Bioworld Technology | BS2287 | |
| 小鼠抗CTBP2抗体 | BD Biosciences | 612044 | |
| 鸡抗GFP抗体 | Aves Labs | GFP1020 | |
| Alexa Fluor标记鬼笔环肽 | Invitrogen | A12379 and A30106 | |
| 荧光原位杂交 | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | ACD Biotechne | 323100 |
| Mm-Marcksl1-C2探针 | ACD Biotechne | 5611771-C2 | |
| Mm-Rxrg探针 | ACD Biotechne | 463141 | |
| Mm-Kcnip3探针 | ACD Biotechne | 561321 | |
| 电生理 | EPC 10 USB膜片钳放大器 | HEKA | -- |
| P-2000拉针仪 | Sutter | -- | |
| MF-930微锻仪 | Narishige | -- | |
| 压电堆栈致动器 | Thorlabs | -- | |
| 900CT八阶贝塞尔滤波器 | Frequency Devices | -- | |
| 成像 | LSM 800共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| scRNA-seq | 小鼠性别（仅雄性）、年龄（P21）、基因型分组（3只Tmie-/-，4只Tmie+/-）、细胞过滤标准（UMI<500剔除） 阅读提示：Methods 'Single-cell RNA sequencing'小节及Results 'Altered SGN transcriptome in Tmie-/- mice' |
| AAV稀疏标记 | 注射年龄（P3）、病毒滴度（AAV9.hSyn.EGFP 1.9*10^13 GC/mL）、注射体积（稀疏标记115 nL）、注射部位（半规管） 阅读提示：Methods 'Labeling of SGNs with AAV'小节及Figure 3图注 |
| NGFR和突触蛋白定量 | 分析年龄（P11、P20-23）、抗体稀释比（NGFR 1:10,000；CTBP2 1:250；GLUR2 1:250）、定量方法（Imaris软件） 阅读提示：Methods 'Tissue collection, immunohistochemistry and in situ hybridization'及'Quantification and statistical analyses'，Figure 4和5图注 |
| 条件敲除 | 他莫昔芬剂量（75 mg/kg）、注射时间（P0和P1）、基因型（Gfi1-GCE;TmieFL/FL）、对照（TmieFL/FL） 阅读提示：Methods 'Conditional knockout of Tmie'小节及Figure 6图注 |
| AAV基因治疗 | 注射年龄（P1）、病毒（AAV.PHP.eB.TMIE::EGFP，滴度5.31×10^12 GC/mL）、注射体积（1 μL）、对照病毒（AAV.PHP.eB.CAG.EGFP） 阅读提示：Methods 'AAV rescue'小节及Figure 10图注 |
| ABR记录 | 麻醉剂（ketamine 100 mg/kg + xylazine 20 mg/kg）、刺激声（click和4, 8, 12, 16, 24, 32 kHz纯音）、降10 dB步进、阈值判定标准 阅读提示：Methods 'Auditory brainstem response (ABRs) recordings'小节 |