侵袭性肺腺癌空间转录组分析
在侵袭性腺癌中解析肿瘤细胞、基质细胞和浸润免疫细胞的空间转录组特征。
对8例IA病例的组织切片进行Visium空间转录组测序，并结合H&E形态学进行聚类和表达谱分析。
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肿瘤微环境的空间分辨基因表达谱揭示肺腺癌发展的关键步骤
Spatially resolved gene expression profiling of tumor microenvironment reveals key steps of lung adenocarcinoma development.
实验完整度
高含30例患者样本、Visium空间转录组、PhenoCycler多重免疫染色及Xenium原位基因表达多层级验证
主要模型
30例肺腺癌患者组织样本 8例侵袭性腺癌fresh frozen及FFPE组织切片 22例原位腺癌/微浸润腺癌组织切片 Visium与Xenium空间转录组及PhenoCycler多重免疫染色体系
重点核对
30例肺腺癌患者样本分为8例侵袭性腺癌和22例AIS/MIA Visium空间转录组分析44个数据集（每个切片获取1张H&E图像） PhenoCycler分析12例代表性病例，每例n=1 Xenium分析17例代表性病例，每例n=1 Xenium预设计与定制面板共302个靶基因（设计ID:9GT3BT）
摘要
肿瘤细胞与其微环境的相互作用被认为是肿瘤发展的关键因素。我们展示了来自30例肺腺癌患者在非侵袭期和后期侵袭期的空间RNA表达谱。我们使用空间转录组测序数据结合原位RNA表达谱分析进行更高分辨率分析。对每个病例的详细检查以及基于观察到的多样表达谱的后续计算分析显示，肿瘤细胞表型外观的显著变化常与免疫细胞特征的变化相关。这一现象与一系列使肿瘤细胞能够转化并突破免疫细胞屏障、从而进一步进展的细胞表达程序诱导同时发生。该研究显示了肺肿瘤如何通过其微环境中的相互作用发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索肺腺癌发生发展过程中肿瘤细胞与微环境细胞（尤其免疫细胞）相互作用的分子和细胞事件。
- 核心机制
- 肿瘤细胞通过改变转录表达程序（如IDO1激活、CCL22阳性细胞招募、SPP1+巨噬细胞与CAF相互作用及EMT等）突破免疫细胞屏障并进一步恶性转化。
- 主要证据
- 基于30例肺腺癌患者样本的Visium空间转录组、Xenium单细胞原位基因表达分析及PhenoCycler多重免疫染色，显示肿瘤细胞表型变化与免疫细胞特征改变相关，并在边界区域观察到IDO1、CCL22、SPP1+巨噬细胞及CAF标志物等表达变化。
- 研究意义
- 研究提示免疫细胞是肿瘤细胞侵袭和扩张的主要屏障，精确控制肿瘤细胞与免疫细胞相互作用可能是治疗不同阶段癌症患者的关键；同时显示仅依赖生物标志物或基因组突变的分类可能无法完全反映肿瘤组织生物学。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代表性病例边界区域高分辨率分析
在单细胞水平解析恶性前沿与低恶性区域边界的肿瘤-免疫细胞相互作用。
对代表性病例LUAD No.2和No.3进行PhenoCycler多重免疫染色和Xenium原位基因表达谱分析，并与Visium数据进行整合。
跨病例TME评分与相关性分析
在更广泛层面归纳空间特异性基因表达谱及其相互关系。
基于PAGE分析对分化、增殖、侵袭和免疫细胞激活/抑制等基因集进行TME评分，并在不同标本间比较。
早期AIS/MIA病例分析
探究在肿瘤发展更早期阶段是否已出现类似的微环境状态变化。
对22例AIS/MIA病例的Visium数据及部分病例的PhenoCycler和Xenium数据进行TME评分和“可能恶性”区域分析。
单细胞水平验证
在单细胞分辨率验证表达谱及其相互作用的假设。
对5个来自Visium分析同组织块的标本进行Xenium原位基因表达分析，并进行Visium数据解卷积和细胞类型分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间转录组测序 | Visium空间基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Visium载玻片 | 10x Genomics | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| FFPE组织RNA提取 | AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA质量检测 | Bioanalyzer分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 多重免疫染色 | PhenoCycler系统 | Akoya Biosciences | -- |
| BZ-X810荧光显微镜 | Keyence | -- | |
| 原位基因表达分析 | Xenium载玻片与样本制备试剂 | 10x Genomics | PN-1000460 |
| Xenium分析仪 | 10x Genomics | -- | |
| 组织切片 | HistoCore MULTICUT R切片机 | Leica | -- |
| CM1950冷冻切片机 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本来源与分组 | 30例肺腺癌患者来源（8例IA和22例AIS/MIA），IA来自National Cancer Center Hospital East，AIS/MIA来自University of Tsukuba Hospital 阅读提示：Methods中Clinical samples小节及Table 1 |
| Visium空间转录组 | 组织切片厚度（FF组织10 µm，FFPE组织5 µm）、组织透化时间（IA 12分钟，AIS/MIA 6分钟）、测序平台NovaSeq 6000 阅读提示：Methods中Spatial transcriptome sequencing using frozen tissues和using FFPE tissues小节 |
| PhenoCycler多重免疫染色 | FFPE切片5 µm、FF切片10 µm、抗原激活压力锅20分钟、35种抗体染色3小时 阅读提示：Methods中Multiplexed immunostaining by PhenoCycler小节及Supplementary Tables S4和S5 |
| Xenium原位基因表达分析 | FFPE切片5 µm、FF切片10 µm、探针50°C过夜杂交、302个靶基因面板设计ID 9GT3BT 阅读提示：Methods中In situ gene expression analysis by Xenium小节及Supplementary Data S1 |
| TME评分与“可能恶性”区域定义 | PAGE富集分析使用Giotto版本1.1.2；“可能恶性”区域阈值设为每切片最高局部富集评分的70%，低于10时设为10，且区域需超过15个spot 阅读提示：Methods中TME scoring analysis和Evaluation of TME changes for early cases小节 |