多组学分析TBEV感染后的宿主细胞变化
全面鉴定TBEV感染引起的蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组变化。
Vero细胞感染TBEV MOI 2.0，在2、6、12、24、48 hpi收集样本，进行LC-MS/MS蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组分析。
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多蛋白质组学分析鉴定蜱传脑炎病毒感染扰动的宿主细胞通路
Multi-protomics analysis identified host cellular pathways perturbed by tick-borne encephalitis virus infection.
实验完整度
高多组学分析结合Vero、A549、T98G细胞、脑类器官及小鼠模型，并进行了功能与机制验证。
主要模型
Vero细胞 A549细胞 T98G细胞 脑类器官 BALB/c小鼠
重点核对
TBEV感染Vero细胞的MOI为2.0，在2、6、12、24、48 hpi收集样本 A549细胞感染TBEV的MOI为2.0，在24和48 hpi检测DDR蛋白 脑类器官感染TBEV后检测γH2AX、53BP1 foci和LC3 puncta BALB/c小鼠腹腔接种10^3 pfu TBEV 药物抗病毒实验在Vero和A549细胞中进行，预处理后感染TBEV 48 h
摘要
蜱传脑炎病毒（TBEV）是欧洲和亚洲引起严重神经系统后果的关键蜱传黄病毒。TBEV基因突变和疫苗突破性感染的出现，以及其他与严重脑炎或出血热相关的蜱传黄病毒缺乏有效疫苗和特异性药物，凸显了理解TBEV及相关黄病毒发病机制和干预策略的迫切需求。在此，我们阐明了TBEV感染后蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组的细胞变化。我们的发现揭示了TBEV感染对先天免疫应答、核糖体生物发生、自噬和DNA损伤应答（DDR）的重大影响。机制上，TBEV的非结构蛋白NS5通过与SIRT1相互作用抑制KAP1和Ku70的去乙酰化，从而阻碍DNA损伤修复。此外，前膜蛋白prM通过与AKT1结合诱导自噬，同时通过与VPS11结合限制自噬溶酶体形成。靶向DDR的抑制剂以及特定激酶表现出强效抗病毒活性，表明失调的通路和激酶是抗病毒干预的潜在靶点。我们的研究结果有助于阐明发病机制，并为开发针对TBEV和其他蜱传黄病毒的有效抗病毒药物提供见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TBEV感染如何扰动宿主细胞蛋白质组、磷酸化蛋白质组和乙酰化蛋白质组，以及哪些宿主通路和病毒蛋白参与其中？
- 核心机制
- TBEV NS5与SIRT1相互作用，抑制KAP1和Ku70的去乙酰化，从而阻碍DNA损伤修复；prM与AKT1结合诱导自噬，同时与VPS11结合限制自噬溶酶体形成。
- 主要证据
- 多组学分析显示TBEV感染影响先天免疫、核糖体生物发生、自噬和DDR；Co-IP和免疫印迹验证NS5-SIRT1、prM-AKT1、prM-VPS11相互作用；脑类器官和小鼠模型验证DDR和自噬变化。
- 研究意义
- 研究结果有助于阐明TBEV的发病机制，并为开发针对TBEV和其他蜱传黄病毒的抗病毒药物提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TBEV感染诱导DNA损伤和DDR激活
验证TBEV感染是否引起DNA损伤并激活DDR通路。
A549细胞感染TBEV MOI 2.0，24和48 hpi检测pDNA-PK、pATR、pATM、pCHK1、pCHK2、pKAP1和γH2AX；彗星实验检测DNA断裂；免疫荧光检测pKAP1、pCHK1和γH2AX foci。
验证NS5通过SIRT1抑制DNA损伤修复
探究NS5是否通过SIRT1影响KAP1和Ku70乙酰化及NHEJ修复效率。
Co-IP验证NS5与SIRT1、SIRT1与Ku70/KAP1相互作用；检测NS5过表达或TBEV感染后KAP1、Ku70、Ku80乙酰化水平；EJ5-GFP报告系统检测NHEJ效率；SIRT1过表达/敲低及SIRT1-H363Y突变体对TBEV复制的影响。
验证prM诱导自噬并抑制自噬溶酶体形成
探究prM对自噬诱导和自噬流的影响及其分子机制。
检测TBEV感染后LC3-I/II转化、GFP-LC3 puncta、自噬体形成；RFP-GFP-LC3检测自噬流；Co-IP验证prM与AKT1、VPS11相互作用；检测prM过表达对AKT1-mTOR磷酸化的影响；siRNA敲低ATG7检测对TBEV复制的影响。
在神经元细胞和脑类器官中验证DDR和自噬变化
在更接近生理的神经元模型和脑类器官中验证TBEV对DDR和自噬的影响。
T98G细胞感染TBEV后检测γH2AX、彗星实验、LC3-II/LC3-I、P62和GFP-LC3 puncta；脑类器官感染TBEV后检测γH2AX、53BP1 foci、LC3 puncta和P62。
药物筛选验证宿主通路作为抗病毒靶点
评估靶向DDR、自噬、激酶和乙酰化调节的药物对TBEV复制的抑制效果。
在Vero和A549细胞中测试37种药物（激酶抑制剂、乙酰化酶抑制剂、SIRT1激动剂、DDR调节剂、自噬抑制剂）对TBEV复制的抑制效果，测定IC50。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | BBI | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 蛋白质组学样本制备 | BCA试剂盒 | Thermo | -- |
| 蛋白质组学分析 | NanoElute系统 | Bruker | -- |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| 免疫共沉淀 | ANTI-FLAG® M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| ANTI-HA亲和凝胶 | Millipore | -- | |
| ANTI-MYC亲和凝胶 | Millipore | -- | |
| 免疫印迹 | 抗Flag标签抗体 | proteintech | 66008-4-Ig |
| 抗MYC标签抗体 | proteintech | 60003-2-Ig | |
| 抗TBEV NS1抗体 | R&D Systems | MAB10106 | |
| 抗HA标签抗体 | proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗磷酸化KAP1 (Ser824)抗体 | abcam | ab133440 | |
| 抗γH2A.X (Ser139)抗体 | abcam | ab81299 | |
| 抗53BP1抗体 | abcam | ab175933 | |
| 抗泛乙酰化抗体 | proteintech | 66289-1-Ig | |
| 抗Vinculin抗体 | proteintech | 66305-1-Ig | |
| 抗Ku70抗体 | Zen-Bioscience | 200995 | |
| 抗Ku80抗体 | Zen-Bioscience | 201004 | |
| 抗LC3抗体 | proteintech | 14600-1-AP | |
| 抗磷酸化ATM (Ser1981)抗体 | Zen-Bioscience | 380751 | |
| 抗ATM抗体 | Zen-Bioscience | R23317 | |
| 抗磷酸化ATR (T1989)抗体 | abcam | ab223258 | |
| 抗ATR抗体 | Zen-Bioscience | 161471 | |
| 抗KAP1抗体 | Zen-Bioscience | R24790 | |
| 抗磷酸化AKT1 (Ser473)抗体 | Zen-Bioscience | 381555 | |
| 抗磷酸化AKT1 (Thr308)抗体 | Zen-Bioscience | 341790 | |
| 抗AKT1抗体 | proteintech | 80457-1-RR | |
| 抗磷酸化mTOR (Ser2448)抗体 | Zen-Bioscience | 381557 | |
| 抗mTOR抗体 | Zen-Bioscience | 380411 | |
| 抗VPS11抗体 | Zen-Bioscience | R389076 | |
| 抗VPS41抗体 | Zen-Bioscience | R26098 | |
| 免疫荧光 | 抗LAMP1抗体 | Beyotime | AF7353 |
| CoraLite488标记山羊抗兔IgG(H+L) | proteintech | SA00013-2 | |
| CoraLite594标记山羊抗鼠IgG(H+L) | proteintech | CL594-67243 | |
| CoraLite 647标记山羊抗鼠重组二抗(H+L) | proteintech | RGAM005 | |
| 彗星实验 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 病毒RNA提取 | TIANamp病毒RNA提取试剂盒 | Tiangen | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒 | TaKaRa | -- |
| 细胞周期分析 | PI/RNase染色缓冲液 | BD Biosciences | -- |
| 衰老相关β-半乳糖苷酶染色 | 衰老相关β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin-V/Caspase-3试剂盒 | Beyotime | C1077S |
| BrdU染色 | 溴脱氧尿苷 | Beyotime | -- |
| 脑类器官培养 | 脑类器官生成试剂盒 | Guidon Pharmaceutics | -- |
| mTeSR 1培养基 | Stem Cell | -- | |
| Y27632 | MCE | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多组学分析样本收集 | Vero细胞感染TBEV的MOI为2.0，在2、6、12、24、48 hpi收集样本 阅读提示：Methods中'Virus strain and in vitro infection'和'Proteome, phosphoproteome and acetylproteome analysis'小节，Fig. 1a图注 |
| DDR蛋白检测 | A549细胞感染TBEV MOI 2.0，24和48 hpi检测；6 mM HU阳性对照 阅读提示：Fig. 3a图注和Methods中'Co-immunoprecipitation and immunoblotting assay'小节 |
| 脑类器官感染 | 脑类器官感染TBEV后检测γH2AX、53BP1 foci和LC3 puncta；感染剂量和时间文中未明确说明 阅读提示：Fig. 5图注和Methods中'Generation of brain organoids'小节 |
| 小鼠感染实验 | 六周龄雌性BALB/c小鼠，每组5只，腹腔接种10^3 pfu TBEV 阅读提示：Methods中'Mice infected with TBEV'小节 |
| 药物抗病毒实验 | Vero和A549细胞预处理药物后感染TBEV 48 h，测定IC50和细胞活力 阅读提示：Fig. 6图注和Results中'Pharmacological modulation of host factors reduces TBEV replication'小节 |