TCGA Hippo信号改变分析
评估Hippo信号在人类癌症基因组中的改变频率与临床相关性
分析32种癌症11706例TCGA样本中Hippo通路组分、YAP/TAZ及TEAD1-4的体细胞改变，统计改变率、组织学分级、肿瘤分期和生存相关性
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人类癌症中Hippo通路体细胞突变的功能注释
Functional annotation of the Hippo pathway somatic mutations in human cancers.
实验完整度
高结合TCGA基因组分析、KO细胞YAP定位筛选、体外激酶、CD、MD及小鼠移植瘤多层级验证
主要模型
HEK293T/HEK293A细胞 Hippo通路组分KO HEK293A细胞 CAL-27舌癌细胞原位移植瘤裸鼠模型 IOMM-Lee脑膜瘤细胞皮下移植瘤裸鼠模型 MCF10A三维acini培养
重点核对
YAP核质定位作为LOF筛选读出，在对应KO细胞中回补野生型与突变体 体外激酶 assay 使用GST-YAP或MBP-LATS1-C3为底物，500 μM冷ATP，30°C 30 min ATP-γ-S结合实验检测ATP结合能力，500 μM ATP-γ-S MOB1原位移植：CAL-27细胞3×10^5注入八周龄雌性裸鼠舌组织，15~17天取样 NF2皮下移植：IOMM-Lee细胞2×10^6注入四周龄雌性裸鼠，JNK-IN-8 10 mg/kg隔日腹腔注射15天
摘要
Hippo通路在癌症发生和进展中常发生改变；然而，该通路如何失调以促进人类癌症发展仍不清楚。本文分析人类癌症基因组中的Hippo体细胞突变并对其靶向Hippo通路的作用进行功能注释。我们共鉴定出85个Hippo通路基因的功能丧失型（LOF）错义突变并阐明其潜在机制。有趣的是，我们揭示锌指结构域是MOB1功能的整合结构，其在头颈癌中的LOF突变促进肿瘤生长。此外，神经鞘瘤/脑膜瘤来源的NF2 LOF突变不仅抑制其在Hippo通路中的抑癌功能，还通过激活VANGL-JNK通路获得致癌作用。总之，本研究不仅为研究人类癌症中Hippo通路提供了丰富的体细胞突变资源，也为基于Hippo的癌症治疗提供了分子基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类癌症中Hippo通路体细胞错义突变如何导致Hippo通路失调并促进癌症发展。
- 核心机制
- MOB1的H161等锌指结构域位点突变破坏蛋白折叠及与LATS1互作；NF2 FERM域LOF突变除抑制Hippo抑癌功能外，还增强与VANGL1结合激活JNK/c-Jun通路获得致癌作用。
- 主要证据
- 在TCGA中分析Hippo信号改变；在Hippo组分KO细胞中筛选约1000个错义突变，鉴定85个LOF突变；通过体外激酶、ATP结合、CD、MD及小鼠移植瘤实验验证LATS1/2、MST1/2、MAP4K2/3、MOB1A/B和NF2突变的功能与机制。
- 研究意义
- 提供人类癌症Hippo通路体细胞突变资源及分子基础，鉴定的Hippo LOF突变可能作为预测YAP激活的基因组生物标志物并指导YAP/TAZ/TEAD靶向化合物的应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Hippo错义突变功能筛选
区分Hippo通路基因错义突变的LOF与中性突变
基于TCGA构建约1000个9个Hippo组分的错义突变体，分别回补至对应KO细胞，以YAP核质定位为读出进行免疫荧光筛选
LATS1/2 LOF突变机制验证
验证LATS1/2 LOF突变对激酶活性及与MOB1互作的影响
纯化LATS1/2 LOF突变蛋白进行体外激酶 assay、ATP-γ-S结合实验、MOB1结合pulldown及MST1诱导HM磷酸化检测，并结合MD分析
MST1/2与MAP4K2/3 LOF突变机制验证
验证激酶域LOF突变对激酶活性、自磷酸化和ATP结合的影响
纯化MST1/2和MAP4K2/3 LOF突变蛋白，进行体外激酶 assay、体内MOB1 T35或LATS1 T1079磷酸化检测、自磷酸化及ATP结合实验，结合CD和MD分析
MOB1 H161 LOF突变功能与锌指结构域验证
确定H161位点及锌指结构域对MOB1抑癌功能的重要性
在MOB1A/B DKO细胞中回补野生型及H161Y/H161D突变体，检测YAP定位、YAP S127磷酸化、下游基因表达；在CAL-27原位移植瘤中验证；通过TAP-MS、pulldown、CD及TPEN/Cd处理分析锌指结构域
NF2 LOF突变致癌机制及体内验证
验证NF2 LOF突变通过VANGL-JNK通路获得致癌作用
在NF2 KO细胞回补NF2 LOF突变体，检测YAP定位与磷酸化、JNK/c-Jun磷酸化；MCF10A 3D acini生长实验；TAP-MS鉴定互作蛋白；VANGL1敲低和JNK-IN-8处理；IOMM-Lee皮下移植瘤验证
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| Western blot | 抗Flag（M2）-过氧化物酶（HRP）抗体 | Sigma-Aldrich | A8592-1MG |
| 抗α-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T6199-200UL | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5441-100UL | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗GFP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390394 | |
| 抗血凝素（HA）抗体 | BioLegend | MMS-101P | |
| 抗磷酸化YAP（Ser127）抗体 | Cell Signaling Technology | 4911S | |
| 抗磷酸化LATS1（Thr1079）抗体 | Cell Signaling Technology | 8654S | |
| 抗磷酸化MST1（Thr183）/MST2（Thr180）抗体 | Cell Signaling Technology | 3681S | |
| 抗磷酸化MOB1（Thr12）抗体 | Cell Signaling Technology | 8843S | |
| 抗磷酸化MOB1（Thr35）抗体 | Cell Signaling Technology | 8699S | |
| 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477S | |
| 抗NF2抗体 | Cell Signaling Technology | 12896S | |
| 磷酸化AKT（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| 抗p44/42 MAPK（Erk1/2）抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 抗磷酸化JNK（Thr183/Tyr185）抗体 | Cell Signaling Technology | 9251S | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252S | |
| 抗磷酸化c-Jun（Ser63）抗体 | Cell Signaling Technology | 9261S | |
| 抗c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 T | |
| 抗VANGL1抗体 | Cell Signaling Technology | 14783S | |
| ATP结合实验 | ATP-γ-S激酶底物 | Abcam | ab138911 |
| 对硝基苄基甲磺酸酯 | Abcam | ab138910 | |
| 抗硫代磷酸酯抗体 | Abcam | ab92570 | |
| Western blot | 抗磷酸化MAP4K2（Ser170）抗体 | Kinexus | AB-PK646 |
| SulfoLink肽偶联树脂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗体纯化 | AminoLink Plus固定与纯化试剂盒 | Pierce | -- |
| 免疫荧光 | 抗YAP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101199 |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F7425-.2MG | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| 药物处理 | 氯化钙 | Sigma-Aldrich | C7902 |
| TPEN锌螯合剂 | Sigma-Aldrich | P4413 | |
| JNK-IN-8 | MedChemExpress | HY-13319 | |
| 氯喹 | MP Biomedicals | 193919 | |
| 质粒构建 | Gateway技术 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| pDONOR201载体 | -- | -- | |
| shRNA | VANGL1 shRNA-1# | Sigma-Aldrich | TRCN0000062092 |
| VANGL1 shRNA-2# | Sigma-Aldrich | TRCN0000290422 | |
| 对照shRNA | Addgene | 136035 | |
| 病毒转染 | 己二甲溴铵（Polybrene） | Sigma-Aldrich | -- |
| 质粒转染 | 聚乙烯亚胺（PEI） | Polysciences | 23966-2 |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | lentiGuide-Puro载体 | Addgene | 52963 |
| lentiCas9-Blast构建体 | Addgene | 52962 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Script逆转录SuperMix试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| CD测量 | Jasco J-810旋光光谱仪 | JASCO | -- |
| TAP-MS | 链霉亲和素偶联磁珠 | GE Healthcare | -- |
| S蛋白磁珠 | Novagen | -- | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| LTQ Orbitrap Elite质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 脂质结合实验 | PIP Strips膜 | Echelon Biosciences | P-6001 |
| 3D培养 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 八孔腔室载玻片系统 | Fisher Scientific | -- | |
| 图像分析 | Image J软件 | -- | -- |
| 动物实验 | 无胸腺裸（nu/nu）小鼠品系 | Jackson Laboratory | 002019 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Hippo错义突变YAP定位筛选 | 9个Hippo基因的对应KO细胞类型、转染后血清饥饿5–6 h、YAP免疫荧光判定标准（核质定位） 阅读提示：Methods中Immunofluorescent staining小节及Fig. 2a图注 |
| 体外激酶实验 | 底物（GST-YAP或MBP-LATS1-C3）、冷ATP 500 μM、30°C 30 min、高盐洗液250 mM NaCl 阅读提示：Methods中In vitro kinase assay小节及Fig. 3c、Fig. 4c、Fig. 5c图注 |
| ATP结合实验 | ATP-γ-S 500 μM、PNBM 2.5 mM室温1 h、抗硫代磷酸酯抗体检测 阅读提示：Methods中ATP-γ-S-based kinase assay小节及Fig. 3l, m、Fig. 5p, q图注 |
| MOB1原位移植瘤实验 | CAL-27细胞3×10^5、八周龄雌性裸鼠、舌组织注射、15~17天取样、n=6只/组、肿瘤体积公式V=length×width2/2 阅读提示：Methods中Animal experiments小节及Fig. 6e, f图注 |
| NF2皮下移植瘤及JNK-IN-8处理 | IOMM-Lee细胞2×10^6、四周龄雌性裸鼠、肿瘤约50 mm3时随机分组、JNK-IN-8 10 mg/kg隔日腹腔注射、15天、n=6只/组 阅读提示：Methods中Animal experiments小节及Fig. 7p, q图注 |
| MCF10A acini 3D生长实验 | 5×10^3细胞、0.5% growth factor-reduced Matrigel、培养4天、n=40 acini/组、Image J定量 阅读提示：Methods中MCF10A acini three-dimensional (3D) growth assay小节及Fig. 7g, h图注 |
| TPEN/Cd处理CD与pulldown | TPEN浓度0、1、2、4 mM、CD缓冲液组成、0.2 μg/μL MBP-MOB1A蛋白 阅读提示：Methods中Circular dichroism (CD) measurement小节及Fig. 6r, s图注 |