建立细菌感染模型并鉴定NK细胞Tim3上调
探究鼠伤寒沙门菌感染期间NK细胞表型变化及Tim3表达动态。
C57BL/6小鼠腹腔感染SL3261，流式细胞术分析脾和肝脏NK细胞成熟、增殖及Tim3表达；对脾NK细胞进行scRNA-seq。
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炎症过程中NK细胞介导的免疫反应中TNFR1和TNFR2信号的对立性结果
Dichotomous outcomes of TNFR1 and TNFR2 signaling in NK cell-mediated immune responses during inflammation.
实验完整度
高包含体外NK细胞培养、多种条件敲除小鼠模型、scRNA-seq及人PBMC数据集再分析，并有功能与机制验证
主要模型
C57BL/6小鼠及Ncr1cre条件敲除小鼠 鼠伤寒沙门菌SL3261感染模型 体外培养的原代小鼠NK细胞 人PBMC scRNA-seq数据集
重点核对
小鼠基因型：Ncr1cre、Ncr1creTim3fl/fl、Ncr1creFSF-Tim3、Ncr1creTnfr1fl/fl、Ncr1creTnfr2fl/fl、Ncr1creTnfr1fl/flTnfr2fl/fl 感染剂量与途径：SL3261 5×10^6 CFU腹腔注射；SL1344 1×10^8 CFU灌胃 检测时间点：感染后第4天取脾和肝脏分析 体外刺激条件：IL-15 10 ng/ml，TNF、IFN-α、TGF-β及通路抑制剂浓度 scRNA-seq分析：n=4 Ncr1cre、4 Ncr1creTnfr1fl/fl、3 Ncr1creTnfr2fl/fl
摘要
自然杀伤（NK）细胞功能受激活性和抑制性信号平衡的调节。肿瘤坏死因子（TNF）是一种在稳态和疾病中普遍存在的炎性细胞因子，但其在NK细胞调节中的作用仍不清楚。在此，我们发现免疫检查点蛋白T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域3（Tim3）的上调是鼠伤寒沙门菌感染期间NK细胞中TNF信号的生物标志物。在NK细胞中条件性缺失TNF受体1（TNFR1）或TNF受体2（TNFR2）的小鼠中，我们发现TNFR1限制细菌清除，而TNFR2促进细菌清除。机制上，通过单细胞RNA测序我们发现TNFR1和TNFR2均诱导Tim3的上调，而TNFR1加速NK细胞死亡，但TNFR2促进NK细胞积累和效应功能。因此，我们的研究强调了炎症期间两种TNF受体对NK细胞的TNF依赖性调节的复杂相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TNF及其两种受体TNFR1和TNFR2如何调节细菌感染期间NK细胞的功能和稳态。
- 核心机制
- TNF通过TNFR1和TNFR2均诱导NK细胞Tim3上调；TNFR1促进NK细胞死亡并限制积累，而TNFR2促进NK细胞积累和效应功能，二者作用部分重叠但结果相反。
- 主要证据
- 利用NK细胞特异性TNFR1、TNFR2或双受体条件敲除小鼠进行鼠伤寒沙门菌感染，结合scRNA-seq、流式细胞术、细胞因子检测和细菌负荷测定，发现TNFR1缺失增加脾NK细胞数并降低脾细菌负荷，TNFR2缺失减少NK细胞数、降低IFN-γ并增加肝细菌负荷。
- 研究意义
- 研究提示Tim3是NK细胞中TNF信号的生物标志物，TNF信号通路是细菌感染期间NK细胞介导免疫的主要调节者，特异性靶向TNFR1或TNFR2可能有助于未来NK细胞免疫治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Tim3在NK细胞中的功能作用
评估Tim3缺失或过表达对NK细胞功能、积累及细菌清除的影响。
构建Ncr1creTim3fl/fl和Ncr1creFSF-Tim3小鼠，体外刺激检测IFN-γ和CD107a，过继转移实验及感染后检测NK细胞数和细菌负荷。
筛选TNF对NK细胞Tim3表达及功能的体外影响
确定TNF是否驱动Tim3表达并影响NK细胞存活、增殖和效应功能。
原代小鼠NK细胞与IL-15及不同浓度TNF、IFN-α、TGF-β培养，检测Tim3、存活和增殖；脾细胞刺激检测CD107a和IFN-γ。
构建NK细胞特异性TNFR条件敲除小鼠并分析感染表型
在体内解析TNFR1和TNFR2对NK细胞表型及细菌清除的各自贡献。
生成Ncr1creTnfr1fl/fl、Ncr1creTnfr2fl/fl和双敲除小鼠，感染SL3261后流式检测Tim3、Ki67、CD69、成熟标志及细菌负荷，并进行scRNA-seq。
机制验证TNFR1与TNFR2对NK细胞死亡和积累的差异作用
确认TNFR1促进细胞死亡而TNFR2促进积累，并关联细菌负荷。
流式检测AnnexinV凋亡、NK细胞计数、Tim3和TIGIT表达、血清IFN-γ及器官细菌负荷；GSEA分析凋亡和增殖通路。
人PBMC数据集再分析验证TNF-Tim3轴相关性
探究小鼠发现是否与人类细菌感染和脓毒症中NK细胞Tim3及TNF信号相关。
再分析已发表的鼠伤寒沙门菌刺激PBMC和脓毒症患者PBMC scRNA-seq数据集，检测HAVCR2、TNFRSF1A、TNFRSF1B表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式分析 | 可固定活性染料440UV | BD Bioscience | -- |
| Fc受体阻断试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| AnnexinV-太平洋蓝 | Biolegend | 640918 | |
| AnnexinV结合缓冲液 | Biolegend | 422201 | |
| FoxP3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 液体计数微球 | BD Biosciences | 335925 | |
| BD FACSymphony A5流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Cytek Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| EdU掺入实验 | Click-IT Plus EdU AF488流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10632 |
| NK细胞分离 | NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi | 130-115-818 |
| NK细胞培养 | Cell Trace Violet染料 | Invitrogen | C34557 |
| IMDM培养基 | Cytiva Life Sciences | SH30228.01 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 人IL-15 | Peprotech | 200-15 | |
| 鼠TNF | Peprotech | 315-01 A | |
| 鼠IFN-α | eBioscience | 14-8312-80 | |
| 鼠TGF-β | eBioscience | 14-8342-80 | |
| BI605906 | Cayman Chemical Company | 19184 | |
| SP600125 | Cayman Chemical Company | 10010466 | |
| Losmapimod | Sigma Aldrich | SML3596 | |
| Amgen16 | Sigma Aldrich | SML2457 | |
| 雷帕霉素 | Cayman Chemical Company | 13346 | |
| 脾细胞刺激 | 抗NK1.1抗体 | BioXCell | BE0036 |
| 莫能霉素 | Biolegend | 420701 | |
| 布雷菲德菌素A | Biolegend | 420601 | |
| 鼠IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| 鼠IL-18 | Gibco | PMC0184 | |
| 细胞因子检测 | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 551866 |
| CBA小鼠TNF Flex试剂盒 | BD Biosciences | 558299 | |
| scRNA-seq | TotalSeq-A哈希标签寡核苷酸 | Biolegend | 155801, 155803, 155805, 155807 |
| Chromium控制器 | 10X Genomics | -- | |
| Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | 1000269 | |
| NovaSeq6000 SP SE100测序流动池 | Illumina | -- | |
| 体内处理 | 抗NK1.1抗体（mIgG2a，克隆PK136） | BioXCell | BE0036 |
| 抗Tim3抗体（大鼠IgG2a，克隆RMT3-23） | BioXCell | BE0115 | |
| 同型对照（大鼠IgG2a，克隆2A3） | BioXCell | BE0089 | |
| 组织处理 | Percoll分离液 | Cytiva Life Sciences | 17089101 |
| 红细胞裂解液 | Biolegend | 420302 | |
| 细菌负荷测定 | Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠感染模型 | 细菌株SL3261、剂量5×10^6 CFU、腹腔注射途径、感染后第4天取样 阅读提示：Methods 'Bacterial strains and in vivo infections'及图注 |
| 条件敲除小鼠基因型 | Ncr1cre、Ncr1creTim3fl/fl、Ncr1creFSF-Tim3、Ncr1creTnfr1fl/fl、Ncr1creTnfr2fl/fl、Ncr1creTnfr1fl/flTnfr2fl/fl的构建与对照 阅读提示：Methods 'Mice' |
| 体外NK细胞培养与刺激 | IL-15 10 ng/ml、TNF 5或10 ng/ml、IFN-α和TGF-β浓度、培养3天、通路抑制剂浓度 阅读提示：Methods 'In vitro NK cell culture' |
| 过继转移实验 | NK细胞来源、50:50混合、5×10^5细胞静脉注射、受体Rag2-/-γc-/-小鼠、感染剂量1×10^6 CFU 阅读提示：Methods 'Adoptive NK transfer' |
| scRNA-seq | 分选标志Lineage-NKp46+NK1.1+、生物学重复数、测序平台和数据分析参数 阅读提示：Methods 'Single-cell RNA-sequencing'及'scRNA-seq computational methods' |