血清蛋白质组DNB模块鉴定
识别预判器官特异性转移的血清分泌组标志物。
对117例肺腺癌患者血清进行LC-MS，检测到1492种蛋白，应用DNB算法鉴定各转移状态相关的蛋白模块，并进行KEGG和GO注释。
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多组学与动态网络生物标志物算法预判肺腺癌器官特异性转移
Multi-omics with dynamic network biomarker algorithm prefigures organ-specific metastasis of lung adenocarcinoma.
实验完整度
高包含血清蛋白质组、单细胞转录组、临床验证队列、小鼠骨转移模型及功能验证
主要模型
117例肺腺癌患者血清（包括无转移及骨、肺、胸膜、脑转移） 18例肺腺癌原发病灶单细胞RNA测序（包括III期无转移及骨、脑、胸膜、肺转移） LLC和KP细胞系心内注射骨转移小鼠模型 肺腺癌骨转移临床样本（单细胞RNA测序n=3对，bulk RNA-seq n=8，IHC n=12）
重点核对
血清DNB蛋白模块与单细胞DNB基因模块重叠筛选，组间比较采用Kruskal-Wallis和Dunn's检验（P<0.05） SAA1在骨转移小鼠模型血清中显著升高（LLC模型P=0.005，KP模型P<0.001） 骨转移灶bulk RNA-seq中SAA1的Log2foldchange约10倍，其余血清蛋白均小于2倍 IHC显示SAA1在骨转移灶阳性率约70%，其他标志物几乎不表达（P<0.001） 血清SAA1在骨转移患者中显著高于健康对照和其他转移组（骨 vs 健康P=0.01；骨 vs Brainplus P=0.008；骨 vs 肺P=0.005；骨 vs 胸膜P=0.005）
摘要
有效检测肺癌转移的策略对于提高肺癌患者生存率具有重要意义。本文中，我们利用动态网络生物标志物（DNB）算法，通过对两个临床队列（涵盖四种主要肺癌远处转移类型）的原发病灶单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和血清液相色谱-质谱数据进行分析，展示了预判肺癌部位特异性转移的标志基因和血清分泌组。同时，我们在每个转移状态轨迹中定位了癌细胞的中间状态及其基因特征，处于该阶段的癌细胞仍无特定器官趋向性。此外，我们成功构建并验证了一个基于过滤后scRNA-seq数据的集成神经网络模型，用于预测癌细胞的转移状态轨迹。总体而言，我们的研究为定位肺癌转移前状态提供了见解，并初步检验了其临床应用价值，有助于以更可行、更有效的方式早期检测肺癌转移。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何早期检测肺腺癌器官特异性转移，并识别转移前状态及预测转移轨迹。
- 核心机制
- DNB算法识别出在转移前临界时间点表达波动剧烈的基因/蛋白模块，这些模块可作为器官特异性转移的早期预警信号；其中SAA1被验证为骨转移的预测标志物。
- 主要证据
- 基于血清LC-MS和原发灶scRNA-seq数据，通过DNB算法鉴定各转移状态标志基因/蛋白；SAA1在骨转移小鼠模型血清中升高，在临床骨转移灶中高表达，且血清SAA1水平在骨转移患者中特异性升高；神经网络模型预测外部数据集转移状态AUC为0.87。
- 研究意义
- 为定位肺癌转移前状态提供了见解，并初步检验了其临床应用价值，有助于以更可行、更有效的方式早期检测肺癌转移。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
原发灶单细胞转录组DNB基因模块鉴定
在单细胞水平定位各转移状态的转移前状态基因模块。
对18例肺腺癌原发灶进行scRNA-seq，获得25,421个细胞，通过拟时序分析构建转移轨迹，划分T0-T4五个阶段，应用DNB算法鉴定各转移位点的基因模块。
血清与单细胞DNB模块重叠筛选候选标志物
筛选可检测的器官特异性血清标志物。
将血清DNB蛋白与原发灶DNB基因重叠，筛选各转移状态共有的基因/蛋白，选择SAA1等作为候选标志物。
SAA1在骨转移小鼠模型中的验证
验证SAA1作为骨转移血清标志物的预测作用。
通过心内注射LLC和KP细胞系构建骨转移小鼠模型，ELISA检测血清SAA1水平，比较有骨转移与无骨转移小鼠。
SAA1在临床队列中的验证
验证SAA1在肺腺癌骨转移中的临床意义和器官特异性。
对配对原发灶和骨转移灶进行scRNA-seq，对骨转移灶进行bulk RNA-seq和IHC染色，检测血清SAA1和YWHAE水平。
中间状态定位及神经网络模型构建与验证
定位癌细胞中间状态并构建预测转移状态的神经网络模型。
利用标志基因表达最大变化率确定中间状态，基于scRNA-seq数据构建神经网络模型，使用外部数据集GSE123902验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血清蛋白组学 | Sep PAKTM C18柱 | Waters | -- |
| Pierce定量多肽检测试剂与标准品 | Thermo Scientific | 23275 | |
| Pierce C18离心柱 | Thermo Scientific | 87777 | |
| nanoElute液相色谱系统 | Bruker Daltonics | -- | |
| TIMS-TOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| bulk RNA-seq | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库构建试剂盒（Illumina） | Vazyme | NR604-02 | |
| Qubit 2.0荧光计 | Life Technologies | Q32866 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| 免疫组化 | EEF2多克隆抗体 | Proteintech | 20107-1-AP |
| RPS3A多克隆抗体 | Proteintech | 14123-1-AP | |
| SAA1多克隆抗体 | Proteintech | 16721-1-AP | |
| 14-3-3E单克隆抗体 | Proteintech | 66946-1-Ig | |
| PSMB6多克隆抗体 | Proteintech | 11684-2-AP | |
| ELISA | SAA1 ELISA试剂盒（小鼠） | EIAab | E0885m |
| SAA1 ELISA试剂盒（人） | EIAab | E0885h | |
| YWHAE ELISA试剂盒（人） | EIAab | E14290h |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 血清蛋白质组DNB分析 | 血清样本来源（117例肺腺癌患者，包括无转移及四种转移类型）、LC-MS检测参数、DNB算法参数 阅读提示：Methods中“Human serum sample preparation and LC–MS analysis”及“DNB selection”小节；Fig. 1a |
| 原发灶单细胞转录组DNB分析 | 18例肺腺癌原发灶样本来源、scRNA-seq数据质控参数（min.cells=3, min.features=200, nFeature_RNA>200 & <2500, percent.mt<20）、拟时序分析参数、DNB算法参数 阅读提示：Methods中“LUAD primary and bone metastatic samples and scRNA-seq”、“Constructing trajectories and pseudo-temporal information with Monocle3”、“DNB selection”及“Statistics and reproducibility”小节 |
| 骨转移小鼠模型构建 | 细胞系（LLC和KP）、小鼠品系（C57BL/6，4-5周龄雄性）、注射细胞量（2×10^5/0.1ml）、注射方式（心内注射）、每组样本量（n=16）、骨转移确认方法（活体荧光成像） 阅读提示：Methods中“Bone metastatic murine model establishment”小节；Fig. 5d |
| SAA1临床验证（scRNA-seq、bulk RNA-seq、IHC、ELISA） | scRNA-seq样本（3对原发灶和骨转移灶）、bulk RNA-seq样本（8例骨转移灶 vs 健康对照正常骨组织）、IHC样本（12例骨转移灶）及抗体稀释度、ELISA样本量（健康对照n=30，骨转移n=10，Brainplus n=14，肺转移n=12，胸膜转移n=11） 阅读提示：Methods中“LUAD primary and bone metastatic samples and scRNA-seq”、“LUAD bone metastatic lesions and bulk RNA-seq”、“IHC staining”、“ELISA”小节；Fig. 6a, j |
| 神经网络模型构建与验证 | 训练集（五个转移轨迹中“after intermediate”状态的癌细胞，合并为三类）、神经网络结构（两个隐藏层10和5个节点，ReLU激活，输出层softmax，损失函数交叉熵，优化器Adam）、外部验证集（GSE123902中GSM3516665和GSM3516664） 阅读提示：Methods中“Integrated neural network for single-cell metastatic status prediction”小节；Fig. 8a |