人鼻黏膜单细胞图谱构建与疾病相关亚群鉴定
解析CRSwNP患者不同解剖区域鼻黏膜的细胞异质性，鉴定与炎症相关的上皮和基质细胞亚群。
采集CRSwNP患者和健康个体的下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉组织，制备单细胞悬液并进行scRNA-seq，聚类注释上皮、基质和免疫细胞亚群，并用转录因子命运决策树和RNA velocity分析分化关系。
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IL-1β诱导的上皮细胞和成纤维细胞转分化促进慢性鼻窦炎伴鼻息肉中的中性粒细胞募集
IL-1β-induced epithelial cell and fibroblast transdifferentiation promotes neutrophil recruitment in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.
实验完整度
高含scRNA-seq、原代细胞及ALI培养、中和抗体功能验证、小鼠模型与IL-1R拮抗剂体内验证
主要模型
CRSwNP患者鼻黏膜组织（下鼻甲、中鼻甲、鼻息肉） 原代人鼻上皮细胞ALI培养 原代人鼻成纤维细胞 LPS诱导的中性粒细胞性CRSwNP小鼠模型
重点核对
scRNA-seq样本：33例样本，219,716个高质量细胞，来自CRSwNP患者和健康个体的下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉 IL-1β刺激浓度与时间：ALI培养的原代人鼻上皮细胞给予10 ng/ml重组IL-1β处理3天；原代人鼻成纤维细胞给予10 ng/ml IL-1β处理1天 中性粒细胞趋化实验：使用3-μm孔径Transwell，条件培养基刺激后37°C孵育3小时计数迁移细胞；并用anti-S100A8/A9或anti-CXCL8中和抗体验证 小鼠模型与给药：C57BL/6小鼠每周3次鼻内滴入10 μg LPS（20 μl PBS），持续3.5个月；从第77天起给予Anakinra 100 μg鼻内（20 μl PBS）和100 μg腹腔（200 μl PBS），LPS刺激后30分钟给药，持续2周，随后2周仅鼻内给药 主要分组与样本量：小鼠随机分为3组，每组6只；免疫荧光定量每组n=6，人NP与HC-IT免疫荧光每组n=6
摘要
中性粒细胞炎症参与多种慢性炎症性气道疾病，包括哮喘和慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP），并与不良预后相关。本文利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析取自CRSwNP患者下鼻甲、中鼻甲和鼻息肉的人鼻黏膜，鉴定出两个IL-1信号诱导的细胞亚群——LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞，它们分别通过向炎症区域释放S100A8/A9和CXCL1/2/3/5/6/8促进中性粒细胞募集。IL-1β是一种参与IL-1信号的促炎细胞因子，可分别诱导原代上皮细胞和成纤维细胞转分化为LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞。在LPS诱导的中性粒细胞性CRSwNP小鼠模型中，用受体拮抗剂阻断IL-1β活性可显著减少LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞数量，并减轻鼻腔炎症。本研究揭示了两个细胞亚群在中性粒细胞募集中的功能，并证明基于IL-1的干预可减轻CRSwNP中的中性粒细胞炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CRSwNP中哪些上皮和基质细胞亚群驱动中性粒细胞炎症，以及IL-1β是否通过诱导这些细胞亚群转分化促进中性粒细胞募集。
- 核心机制
- IL-1β通过IL-1信号诱导LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞分别从原代上皮细胞和成纤维细胞转分化；LY6D+棒状细胞释放S100A8/A9，IDO1+成纤维细胞释放CXCL1/2/3/5/6/8，促进中性粒细胞募集。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定细胞亚群及趋化因子-受体互作网络；原代人鼻上皮细胞ALI培养和原代成纤维细胞经IL-1β刺激后出现相应细胞状态并分泌S100A8/A9或CXCL8，中和抗体降低趋化能力；LPS诱导的CRSwNP小鼠模型中Anakinra减少LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞并减轻炎症。
- 研究意义
- 研究揭示了CRSwNP中性粒细胞炎症的关键细胞亚群和IL-1信号机制，提示靶向IL-1β及这些细胞亚群的转分化可能成为减轻CRSwNP中性粒细胞炎症的干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞募集相关细胞亚群的鉴定与组织学验证
确定哪些上皮和基质细胞亚群与中性粒细胞浸润相关。
利用xCell评估bulk RNA-seq中中性粒细胞浸润；整合中性粒细胞scRNA-seq数据构建趋化因子-趋化因子受体互作网络；免疫荧光检测LY6D+棒状细胞、IDO1+成纤维细胞与MPO+中性粒细胞的空间分布。
IL-1β诱导上皮细胞转分化为LY6D+棒状细胞及功能验证
验证IL-1β能否诱导原代鼻上皮细胞获得LY6D+棒状细胞状态并增强中性粒细胞趋化。
原代人鼻上皮细胞ALI培养后给予重组IL-1β，bulk RNA-seq和免疫荧光检测LY6D/S100A8表达，ELISA检测S100A8/A9分泌，Transwell趋化实验检测条件培养基的中性粒细胞趋化能力及anti-S100A8/A9中和抗体的作用。
IL-1β诱导成纤维细胞转分化为IDO1+成纤维细胞及功能验证
验证IL-1β能否诱导原代鼻成纤维细胞获得IDO1+成纤维细胞状态并增强中性粒细胞趋化。
原代人鼻成纤维细胞（来自下鼻甲和鼻息肉）给予IL-1β，bulk RNA-seq检测趋化因子表达，免疫荧光检测IDO1和CXCL8，ELISA检测CXCL8分泌，Transwell趋化实验检测条件培养基的中性粒细胞趋化能力及anti-CXCL8中和抗体的作用。
IL-1R拮抗剂体内阻断验证
验证阻断IL-1β活性能否抑制LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞转分化并减轻中性粒细胞炎症。
建立LPS诱导的中性粒细胞性CRSwNP小鼠模型，给予Anakinra治疗，检测鼻灌洗液细胞计数和CXCL1/TNF水平、鼻黏膜HE和MPO染色，以及LY6D+棒状细胞和IDO1+成纤维细胞数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织消化 | 多组织解离试剂盒2 | MACS | 130-110-203 |
| 单细胞悬液制备 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 红细胞裂解液 | Thermo Fisher | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma–Aldrich | A7906 | |
| scRNA-seq文库构建 | DNBelab C系列高通量单细胞系统 | BGI-research | -- |
| scRNA-seq文库质控 | Qubit单链DNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Agilent Bioanalyzer 2100 | Agilent | -- | |
| scRNA-seq测序 | DIPSEQ T1测序平台 | -- | -- |
| 免疫荧光染色 | 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Solarbio | C006 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Solarbio | S2100 | |
| 多重免疫组织化学 | Opal 6重检测试剂盒 | AKOYA | 811001 |
| 原代人鼻上皮细胞培养 | 支气管上皮细胞培养基 | ScienCell | 3211 |
| I型胶原 | Corning | 354236 | |
| 原代人鼻上皮细胞ALI培养 | 聚酯Transwell小室（0.4 µm，0.33 cm2） | BIOFIL | TCS016012 |
| 原代人鼻上皮细胞刺激 | 重组IL-1β | Abbkine | PRP100051 |
| 原代人鼻成纤维细胞培养 | 青霉素-链霉素溶液 | Solarbio | P1400 |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Macgene | CC017-500 | |
| 中性粒细胞分离 | Polymorphprep密度梯度分离液 | Serumwerk Bernburg AG | 1895 |
| 中性粒细胞趋化实验 | 3-μm孔径24孔Transwell板 | Costar | 3415 |
| ELISA | ELISA试剂盒 | 4A Biotech | CHE0011, CME0008, CME0004 |
| ELISA检测 | Varioskan Flash酶标仪 | Thermo Fisher | -- |
| 小鼠鼻灌洗液细胞涂片 | 红细胞裂解液 | Servicebio | G2015 |
| 瑞氏-吉姆萨染色试剂盒 | Beyotime | C0131 | |
| HE染色 | HE染色试剂盒 | Beyotime | C0105S |
| 小鼠模型给药 | 阿那白滞素 | MedChemExpress | HY-108841 |
| 小鼠模型造模 | 大肠杆菌来源脂多糖 | Sigma–Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人鼻黏膜单细胞图谱 | 样本来源与分组：CRSwNP患者下鼻甲n=9、中鼻甲n=7、鼻息肉n=15，健康对照下鼻甲n=2；患者年龄18-70岁，术前至少4周未使用全身糖皮质激素 阅读提示：Methods“Study participants”与“Preparation of single-cell suspensions”，Supplementary Table 1 |
| 原代人鼻上皮细胞ALI培养与IL-1β刺激 | IL-1β浓度10 ng/ml、处理3天；ALI分化21天；BEpiCM与DMEM/F12按1:1配制分化培养基 阅读提示：Methods“Isolation and culture of primary human nasal epithelial cells (HNEs)”，Fig. 5a–f |
| 原代人鼻成纤维细胞IL-1β刺激 | IL-1β浓度10 ng/ml、处理1天；成纤维细胞来源为下鼻甲或鼻息肉组织 阅读提示：Methods“Isolation and culture of primary human nasal fibroblasts (HNFs)”，Fig. 5g–k |
| 中性粒细胞趋化实验 | Transwell孔径3 μm；孵育37°C 3小时；中和抗体种类及稀释比例见Supplementary Table 2；每组n=4或n=8 阅读提示：Methods“Neutrophil chemotaxis assay”，Fig. 5f、5k及图注 |
| LPS诱导中性粒细胞性CRSwNP小鼠模型与Anakinra治疗 | LPS 10 μg/20 μl PBS，每周3次，持续3.5个月；Anakinra从第77天起100 μg鼻内+100 μg腹腔，LPS后30分钟给药，持续2周，随后2周仅鼻内给药；每组6只 阅读提示：Methods“Neutrophilic CRSwNP mouse model and treatment with an IL-1R antagonist (Anakinra)”，Supplementary Fig. 8c |