建立B. pseudomallei感染诱导巨噬细胞线粒体自噬的模型
验证B. pseudomallei感染是否诱导线粒体自噬及其对常规自噬的依赖。
用B. pseudomallei感染RAW264.7和PMs，检测Δψm、mtDNA、HSP60/TIM23、LC3共定位、TEM及Lysotracker共定位；并用Atg5、Atg7、FIP200敲低验证。
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Burkholderia pseudomallei BipD通过调控宿主线粒体自噬逃避杀伤
Burkholderia pseudomallei BipD modulates host mitophagy to evade killing.
实验完整度
高含巨噬细胞体外模型、基因敲除/敲低、小鼠感染模型及IP-MS/泛素组等多层证据，并有功能与机制验证
主要模型
RAW264.7小鼠巨噬细胞 小鼠腹腔巨噬细胞(PMs) HEK293T细胞 BALB/c小鼠B. pseudomallei腹腔感染模型
重点核对
B. pseudomallei感染MOI 10、1 h感染后换含250 µg/ml卡那霉素培养基，按指定时间点检测 RAW264.7、PMs及Cul3−/−、Immt−/− RAW264.7细胞的基因敲除/敲低验证 CCCP 10 µM、MitoTEMPO 0.5 mM、MLN4924 300 nM、MG132 10 µM、Baf A1 100 nM、CHX 20 µM等处理条件 小鼠i.p.感染4×10^5 CFU B. pseudomallei，次日i.p.给予CCCP 5 mg/kg、MitoTEMPO 100 mg/kg或MLN4924 30 mg/kg 检测终点包括mtDNA/nDNA、HSP60/TIM23、LC3共定位、mtROS、细菌CFU及生存率
摘要
线粒体自噬对线粒体质量控制和功能至关重要，可清除受损线粒体。本研究发现，Burkholderia pseudomallei通过III型分泌系统针尖蛋白BipD操控宿主线粒体自噬以促进其胞内生存。我们发现BipD通过与Back和Kelch结构域结合，与含BTB结构域的蛋白KLHL9和KLHL13相互作用，并在B. pseudomallei感染时招募NEDD8家族RING E3连接酶CUL3。尽管KLHL9/KLHL13/CUL3 E3连接酶复合物明显不参与感染性疾病的调控，但其对小鼠巨噬细胞中BipD依赖的线粒体泛素化至关重要。机制上，我们通过宿主泛素组分析发现线粒体内膜蛋白IMMT是KLHL9/KLHL13/CUL3复合物的底物。值得注意的是，IMMT K211的K63连接泛素化是启动宿主线粒体自噬所必需的，从而减少线粒体ROS产生。我们在此展示了细菌病原体劫持宿主线粒体自噬以促进生存的独特机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B. pseudomallei是否以及如何调控宿主线粒体自噬以促进其胞内生存。
- 核心机制
- BipD与KLHL9/KLHL13/CUL3 E3连接酶复合物互作，促进IMMT K211的K63连接泛素化并经自噬-溶酶体途径降解，启动线粒体自噬并降低mtROS。
- 主要证据
- 在RAW264.7、PMs及HEK293T细胞中通过敲低/敲除、共免疫沉淀、泛素组学、UbiCRest和mt-Keima等验证；小鼠感染模型显示MLN4924处理降低WT菌载量并提高生存率，对ΔbipD无显著影响。
- 研究意义
- 揭示了病原体通过效应蛋白劫持宿主线粒体自噬逃避杀伤的机制，为理解B. pseudomallei感染与免疫逃逸提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证线粒体自噬对胞内细菌存活及mtROS的调控
明确线粒体自噬是否通过降低mtROS促进B. pseudomallei胞内生存。
用CCCP或MitoTEMPO处理细胞和小鼠，检测mtROS、胞内细菌CFU及肝脾载量。
鉴定BipD为介导线粒体自噬的效应蛋白
确定B. pseudomallei诱导的线粒体自噬是否依赖BipD并验证其分泌。
筛选含LIR motif的T3SS蛋白，构建ΔbipD及回补株，检测mtDNA、HSP60/TIM23、LC3共定位、Δψm和细菌复制；用β-内酰胺酶报告系统检测BipD-TEM分泌。
解析BipD与KLHL9/KLHL13/CUL3复合物的互作
确定BipD的宿主互作蛋白及结合结构域。
IP-MS筛选BipD结合蛋白，Co-IP和GST pulldown验证BipD与KLHL9、KLHL13及CUL3的相互作用，并用KLHL9/KLHL13缺失突变体定位结合区域。
鉴定IMMT为KLHL9/KLHL13/CUL3复合物底物并验证泛素化类型
明确BipD招募的E3连接酶复合物泛素化线粒体底物的身份及修饰类型。
泛素组学筛选线粒体底物，Co-IP验证IMMT泛素化；用UbiCRest和K63-only泛素突变体验证K63连接；用K211R突变体确定修饰位点；用CHX、MG132、Baf A1确定降解途径。
验证CUL3和IMMT在BipD介导线粒体自噬及体内感染中的作用
确认CUL3和IMMT K211对线粒体自噬、mtROS清除及细菌存活/毒力的必要性。
构建Cul3−/−和Immt−/− RAW264.7，检测mtDNA、HSP60/TIM23、LC3/LAMP1共定位、mt-Keima、mtROS和胞内CFU；小鼠感染后给予MLN4924，观察生存率和肝脾载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091148 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050079 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| 药物处理 | CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 |
| Mdivi-1 | Sigma-Aldrich | M0199 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MLN4924 | ApexBio | B1036 | |
| MG132 | ApexBio | A2585 | |
| 巴弗洛霉素A1 | ApexBio | A8627 | |
| 细菌培养 | 卡那霉素 | TIANGEN | RT503 |
| 动物实验 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D4540 |
| 羟丙基-β-环糊精 | Sigma-Aldrich | 332607 | |
| Western blot | HSP60小鼠单克隆抗体 | Beyotime | AF0186 |
| HSP60兔单克隆抗体 | Beyotime | AF1771 | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| Western blot/免疫荧光 | TIM23抗体（克隆32） | BD Biosciences | 611222 |
| LC3A/LC3B抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16931 | |
| Western blot | Flag抗体 | Zenbio | R24091 |
| 免疫荧光 | SQSTM1抗体 | Invitrogen | MA5-27800 |
| TOMM20抗体 | Abcam | ab186735 | |
| Western blot | GST抗体 | Abclonal | AE077 |
| KLHL9抗体 | Abcam | ab230542 | |
| KLHL13抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-31658 | |
| Xpress抗体 | Thermo Fisher Scientific | R910-25 | |
| 免疫荧光 | 泛素化蛋白抗体（克隆FK2） | Millipore | 04-263 |
| Western blot | Cullin 3抗体 | Abcam | ab75851 |
| 泛素抗体（克隆P4D1） | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| DnaK抗体 | Abcam | ab69617 | |
| Mitofilin抗体 | Abcam | ab137057 | |
| Myc抗体 | Beyotime | AF0033 | |
| HA抗体 | Thermo Fisher Scientific | 26183 | |
| 免疫荧光 | LAMP1抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA1-164 |
| Western blot | KIF5B抗体 | Abcam | ab167429 |
| DYNLL1抗体 | Abcam | ab51603 | |
| ATG5抗体 | CST | 12994T | |
| ATG7抗体 | CST | 8558T | |
| FIP200抗体 | Abclonal | A14685 | |
| PINK1抗体 | CST | 6946 | |
| Parkin抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA513399 | |
| NLRX1抗体 | ABclonal | A4976 | |
| BNIP3L抗体 | Zenbio | 381891 | |
| BNIP3抗体 | Zenbio | R23308 | |
| FUNDC1抗体 | Zenbio | 251933 | |
| BAX抗体 | Zenbio | R22708 | |
| BAK抗体 | Abclonal | A0204 | |
| DRP1抗体 | Abclonal | A2586 | |
| 免疫荧光 | 驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21203 |
| 山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| Western blot | 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG抗体 | CST | 7074 |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体 | CST | 7076 | |
| RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B | |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693159001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23227 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| SuperSignal ECL化学发光底物检测试剂盒 | Invitrogen | 34580 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | TaKaRa | RR047A | |
| Platinum SYBR Green qPCR预混液 | Thermo Fisher | 11733046 | |
| mtDNA提取 | TaKaRa MiniBEST通用基因组DNA提取试剂盒Ver.5.0 | TaKaRa | 9765 |
| 免疫荧光 | DAPI | Thermo Fisher | 62248 |
| 抗淬灭封片剂 | Invitrogen | S36967 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000015 |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | Yeasen | 40804ES76 |
| 细菌培养 | Triton X-100 | AMRESCO | -- |
| 共免疫沉淀 | 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| GST pulldown | Pierce GST蛋白相互作用pull-down试剂盒 | Thermo Scientific | 21516 |
| 泛素组学 | NHS活化Sefinose | Sangon Biotech | C600024 |
| C18 SepPak固相萃取柱 | Welch Materials | 00559-11002 | |
| 流式分析 | MitoSOX | Thermo Fisher | M36008 |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| UbiCRest | USP21 | Lifesensor | DB-0509-0025 |
| YOD1 | Fitzgerald | 80R-2723 | |
| AMSH | Lifesensor | DB-0301-0025 | |
| OTUB1 | Lifesensor | DB-0201-0025 | |
| T3SS分泌检测 | CCF2-AM | Thermo Fisher Scientific | K1023 |
| 细菌培养 | 谷胱甘肽琼脂糖 | GE Healthcare | -- |
| Ni-NTA琼脂糖 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| B. pseudomallei感染细胞 | MOI 10、感染1 h后250 µg/ml卡那霉素处理、各检测时间点 阅读提示：Methods中Cells小节及图注 |
| 药物处理 | CCCP 10 µM、MitoTEMPO 0.5 mM、MLN4924 300 nM、MG132 10 µM、Baf A1 100 nM、CHX 20 µM、Mdivi-1 20 µM及处理时间 阅读提示：Methods中Cells小节 |
| 小鼠感染与给药 | BALB/c小鼠6–8周、i.p. 4×10^5 CFU、CCCP 5 mg/kg、MitoTEMPO 100 mg/kg、Mdivi-1 50 mg/kg、MLN4924 30 mg/kg及给药时间 阅读提示：Methods中Infection of mice小节 |
| 基因敲除/敲低验证 | Cul3−/−、Immt−/− RAW264.7克隆验证；Klhl9/Klhl13/Cul3 shRNA敲低效率 阅读提示：Methods中Knockout of Cul3 or Immt及Generation of stable knockdown cell lines小节 |
| 泛素组学与IP-MS | 每组n=4（IP-MS）或n=3（泛素组学）、CCCP 20 mM处理8 h 阅读提示：Methods中IP-MS和Ubiquitin proteomics analysis小节 |