构建NRF2稳定性荧光报告系统并筛选化合物
筛选能促进NRF2蛋白降解的化合物
构建DsRed-IRES-EGFP-NRF2（RIG-NRF2）报告系统并稳定转染A549细胞，用805个化合物库进行筛选，以CHX处理组为100%降解参照计算NRF2下降百分比。
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PPIA决定NRF2稳定性从而促进肺癌进展
PPIA dictates NRF2 stability to promote lung cancer progression.
实验完整度
高含NSCLC细胞系、CRISPR敲除、蛋白互作与泛素化、X射线共晶结构、PDX及异种移植模型等多层级功能与机制验证
主要模型
NSCLC细胞系（A549、H2030、H1650、H1975等） HEK293T细胞 A549-Luc尾静脉肺原位裸鼠模型 NSCLC患者来源异种移植（PDX）模型（MT-101、WT-201等）
重点核对
PPIA敲除或CsA处理（10 μM）后NRF2蛋白水平及CHX追踪的半衰期 MG132处理后免疫沉淀检测NRF2泛素化水平 PPIA WT与催化失活突变体（R55A&F60A）对NRF2水平的回补能力 NRF2 P174A突变体与PPIA结合及蛋白稳定性 CsA（20 mg/kg，i.p.，每3天）与CB-839（150 mg/kg，p.o.，每日两次）联合在PDX和肺原位模型中的疗效
摘要
核因子红系2相关因子2（NRF2）过度活化已被确立为包括非小细胞肺癌（NSCLC）在内的多种人类癌症的致癌驱动因素。然而，尽管付出巨大努力，目前仍没有特异性疗法靶向NRF2过度活化。在此，我们鉴定出肽基脯氨酰异构酶A（PPIA）是NRF2蛋白稳定性所必需的。敲除PPIA促进NRF2蛋白降解并阻断NSCLC细胞中NRF2驱动的生长。机制上，PPIA与NRF2物理结合并阻断泛素/Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1）接近NRF2，从而阻止泛素介导的降解。我们的X射线共晶结构揭示，PPIA通过一个含有反式脯氨酸174的疏水序列直接与NRF2结构域间连接区相互作用。我们进一步证明，FDA批准的药物环孢菌素A（CsA）破坏NRF2与PPIA的相互作用，诱导NRF2泛素化和降解。有趣的是，CsA干扰由NRF2/KLF5/SLC1A5通路介导的谷氨酰胺代谢，从而抑制NRF2过度活化的NSCLC细胞的生长。CsA与谷氨酰胺酶抑制剂联合治疗显著延缓NRF2过度活化的NSCLC患者来源异种移植（PDX）模型中的肿瘤进展。我们的研究表明，靶向NRF2蛋白稳定性是治疗NRF2过度活化NSCLC的一种可行的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NRF2过度活化的NSCLC缺乏直接靶向NRF2的疗法，能否通过调控NRF2蛋白稳定性找到可成药的治疗策略。
- 核心机制
- PPIA结合NRF2的P174所在PBM基序，阻断KEAP1/泛素接近NRF2，抑制泛素-蛋白酶体降解；CsA破坏该互作，诱导NRF2降解并干扰NRF2/KLF5/SLC1A5介导的谷氨酰胺代谢。
- 主要证据
- 在NSCLC细胞中PPIA敲除缩短NRF2半衰期并增加其泛素化，X射线共晶结构显示P174嵌入PPIA催化口袋，CsA联合谷氨酰胺酶抑制剂在A549肺原位模型和NRF2过度活化PDX模型中协同抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 研究表明靶向NRF2蛋白稳定性是治疗NRF2过度活化NSCLC的可行动治疗途径，并为CsA联合谷氨酰胺酶抑制剂的精准治疗提供潜在框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CsA诱导NRF2蛋白酶体降解
确认CsA通过泛素-蛋白酶体途径降低NRF2蛋白水平
在A549和H2030细胞中检测CsA处理后NRF2蛋白和mRNA水平，并用MG132逆转实验及泛素化免疫沉淀检测降解途径。
建立PPIA敲除细胞并验证NRF2稳定性
确定PPIA对NRF2蛋白稳定性和CsA诱导降解的必要性
用CRISPR/Cas9在A549、H2030、H460和H2122细胞中敲除PPIA，检测NRF2蛋白水平、泛素化及CHX追踪的半衰期，并用WT或催化失活PPIA回补。
解析PPIA与NRF2的相互作用及结构基础
确定PPIA与NRF2结合的结构域和关键氨基酸
通过Co-IP、Pull-down、NRF2截短体和脯氨酸点突变定位结合区域，并解析PPIA与NRF2 PBM肽段的X射线共晶结构及NMR化学位移扰动。
验证PPIA抑制对谷氨酰胺代谢的影响
确定PPIA抑制是否通过SLC1A5影响谷氨酰胺摄取和代谢
在PPIA敲除或CsA处理的A549和H2030细胞中检测谷氨酰胺依赖生长、OCR、13C5-谷氨酰胺代谢流、谷氨酰胺转运体表达及细胞内谷氨酰胺含量。
阐明NRF2-KLF5-SLC1A5转录调控轴
确定NRF2调控SLC1A5转录的分子路径
通过启动子荧光素酶报告、ChIP-PCR和回补实验验证NRF2通过KLF5激活SLC1A5转录。
评估CsA与谷氨酰胺酶抑制剂联合的体内疗效
验证联合治疗在NRF2过度活化NSCLC模型中的抗肿瘤效果
在A549-Luc尾静脉肺原位模型、人源化NCG小鼠异种移植模型和NSCLC PDX模型中评估CsA与CB-839单用及联合的疗效。
分析PPIA和NRF2的临床相关性
评估PPIA和NRF2表达与NSCLC临床预后之间的关系
对69例人LUAD组织芯片进行PPIA和NRF2免疫组化及Kaplan-Meier生存分析，并用公共数据库GSE8894和Kaplan-Meier plotter分析基因表达与生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Western blot | NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP |
| PPIA抗体 | Proteintech | 10720-1-AP | |
| 泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| SLC1A5抗体 | Proteintech | 20350-1-AP | |
| KLF5抗体 | Proteintech | 21017-1-AP | |
| KEAP1抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 荧光素酶报告基因实验 | Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| NanoBRET实验 | HaloTag NanoBRET 618配体 | Promega | -- |
| 呋喃嗪 | -- | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| Pull-down实验 | CNBr活化琼脂糖4B珠 | GE Healthcare | -- |
| ChIP实验 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| qPCR | Hifair II第一链cDNA合成预混液 | Yeasen | -- |
| Hifair III一步法RT-qPCR SYBR Green试剂盒 | Yeasen | -- | |
| 谷氨酰胺检测 | 谷氨酰胺/谷氨酸-Glo检测试剂盒 | Promega | -- |
| 耗氧率分析 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA柱 | Thermofisher | -- |
| 结晶 | PEG 3350 | -- | -- |
| TCEP | -- | -- | |
| 动物实验 | D-荧光素 | -- | -- |
| CB-839 | -- | -- | |
| 环孢菌素A | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RIG-NRF2化合物筛选 | A549-RIG-NRF2稳定细胞系；CHX（10 μM）作为100%降解对照；CsA（10 μM）处理；流式细胞术门控策略 阅读提示：Methods中RIG-NRF2 Screen小节及Fig. 1D图注 |
| PPIA敲除与NRF2稳定性 | sgPPIA#1和sgPPIA#2序列；嘌呤霉素（5 μg/mL）筛选；CHX（100 μg/mL）追踪时间点；PPIA WT或R55A&F60A回补 阅读提示：Methods中CRISPR/Cas9 mediated PPIA gene knockout小节及Fig. 2、Fig. 3F图注 |
| CsA与CB-839联合体内治疗 | CB-839 150 mg/kg，p.o.，每日两次；CsA 20 mg/kg，i.p.，每3天；每组n=6只小鼠；PDX模型基因型（MT-101为KEAP1/KRAS突变，WT-201为野生型） 阅读提示：Methods中Lung orthotopic model和Patient-derived xenograft (PDX)小节及Fig. 6C、6F、6G图注 |
| 谷氨酰胺代谢流分析 | 13C5-glutamine（2 mM）标记8小时；LC-MS/MS检测TCA代谢物；谷氨酰胺浓度2、1、0.5 mM 阅读提示：Methods中Stable-isotope labeling and metabolic flux analysis小节及Fig. 4A、Supplementary Fig. 6 |
| NRF2-KLF5-SLC1A5转录调控 | SLC1A5启动子（-2000至+100 bp及-500至-10 bp截短体）；KLF5启动子（-4000至0 bp）；ChIP-PCR所用NRF2和KLF5抗体用量（5 μg） 阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation小节及Fig. 5A-5F图注 |