建立功能障碍脂肪细胞小鼠模型并评估肿瘤进展
探究功能障碍脂肪细胞对肿瘤生长的影响
利用BaKO小鼠、PyBaKO小鼠以及BECN1缺陷脂肪细胞与癌细胞共注射模型，评估多种同系肿瘤模型的生长、转移和生存。
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功能障碍脂肪细胞通过YAP/TAZ依赖的癌相关脂肪细胞转化促进肿瘤进展
Dysfunctional adipocytes promote tumor progression through YAP/TAZ-dependent cancer-associated adipocyte transformation.
实验完整度
高包含体外脂肪细胞模型、多种同系肿瘤移植模型、转基因自发乳腺癌模型、基因敲除小鼠及药理学抑制验证，并有机制验证。
主要模型
脂肪细胞特异性BECN1敲除（BaKO）小鼠 BECN1/YAP/TAZ三敲除（BYTaKO）小鼠 BECN1缺陷永生化基质血管细胞（imSVC）诱导的脂肪细胞 EO771和MC-38同系肿瘤移植模型
重点核对
BaKO小鼠中MC-38和EO771肿瘤生长加速，而黑色素瘤和肺癌细胞未加速 PyBaKO小鼠肿瘤发生率和肺转移增加、死亡率升高 Becn1 KO脂肪细胞与4T1细胞共注射促进肿瘤生长 BYTaKO小鼠中BaKO的脂肪营养不良和炎症表型恢复且肿瘤生长受抑 维替泊芬（30 mg/kg，隔日腹腔注射）抑制BaKO和HFD喂养小鼠的肿瘤进展
摘要
肥胖已成为恶性肿瘤发展的重要危险因素。然而，现有关于脂肪细胞在肿瘤微环境（TME）中作用以阐明肥胖与癌症相关性的文献仍不充分。在此，我们旨在利用携带功能障碍脂肪细胞的小鼠模型研究癌相关脂肪细胞（CAAs）的形成及其对肿瘤生长的贡献。具体而言，我们采用脂肪细胞特异性BECN1敲除（BaKO）小鼠，其因脂肪细胞功能障碍而表现出脂肪营养不良。我们的结果揭示，在CAAs和BECN1缺陷脂肪细胞中YAP/TAZ信号均被激活，诱导脂肪细胞去分化和恶性TME的形成。从BaKO小鼠中额外删除YAP/TAZ可显著恢复脂肪营养不良和炎症表型，导致肿瘤消退。此外，喂食高脂饮食（HFD）的小鼠其脂肪组织中BECN1降低而YAP/TAZ表达升高。使用YAP/TAZ抑制剂维替泊芬治疗可抑制BaKO和HFD喂养小鼠的肿瘤进展，突显其对代谢失调小鼠的疗效。总体而言，我们的发现提供了对CAA关键介质的见解及其在TME发展中的意义，从而提示了一种靶向脂肪细胞稳态以抑制癌症生长的可行方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 功能障碍脂肪细胞如何促进肿瘤进展，以及BECN1和YAP/TAZ在癌相关脂肪细胞转化中的作用是什么？
- 核心机制
- BECN1缺失通过其非自噬功能减弱与MOB1的相互作用，导致YAP/TAZ信号激活，诱导脂肪细胞去分化和CAAs形成，分泌TNFα和LCN2等促炎/致癌因子，营造促肿瘤微环境。
- 主要证据
- 在BaKO小鼠、BECN1缺陷脂肪细胞与癌细胞共培养/共注射模型、BYTaKO小鼠以及维替泊芬处理小鼠中，通过肿瘤生长监测、RNA-seq、GSEA、PLA、Western blot、ELISA和荧光素酶报告基因等实验证实。
- 研究意义
- 研究提示靶向脂肪细胞稳态（如抑制YAP/TAZ）可能为抑制癌症生长提供可行途径，尤其对于肥胖和糖尿病等代谢失调患者。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定BECN1缺陷脂肪细胞的促炎和促肿瘤分泌因子
明确BECN1缺失脂肪细胞分泌哪些因子支持肿瘤生长
对BaKO iWAT进行RNA-seq和GSEA，检测TNFα和LCN2表达与分泌，利用条件培养基和重组蛋白处理癌细胞，并进行LCN2R敲低实验。
比较CAAs与BECN1缺陷脂肪细胞的表型和信号特征
验证BECN1缺陷脂肪细胞是否获得CAAs样去分化表型及YAP/TAZ激活
将脂肪细胞与EO771共培养，检测脂肪生成标志物和BECN1表达；对 naive、瘤周和BaKO WAT进行RNA-seq和GSEA；检测YAP/TAZ表达和核转位。
验证BECN1调控YAP/TAZ不依赖自噬
确定BECN1缺失激活YAP/TAZ是否通过自噬途径
使用自噬抑制剂（巴弗洛霉素A和羟氯喹）处理脂肪细胞，构建ATG7aKO小鼠，进行siATG7和siBECN1转染实验，并检测YAP/TAZ表达和核转位。
解析BECN1通过MOB1调控Hippo通路的分子机制
阐明BECN1缺失如何导致YAP/TAZ激活
利用PLA检测BECN1与Hippo通路蛋白的相互作用，过表达BECN1、YAP1、LATS1、MST1和MOB1，检测MOB1和p-YAP水平。
遗传学验证YAP/TAZ在BECN1缺失脂肪细胞促肿瘤中的作用
确认YAP/TAZ介导BECN1缺陷脂肪细胞的促肿瘤效应
构建BYTaKO小鼠，评估脂肪组织表型、炎症标志物和肿瘤生长；进行CHIP-seq分析和荧光素酶报告基因实验验证YAP-TEAD对LCN2的转录调控；进行BYT KO脂肪细胞与癌细胞共培养。
药理学抑制YAP/TAZ验证治疗潜力
评估YAP/TAZ抑制剂维替泊芬对BaKO和HFD喂养小鼠肿瘤进展的影响
在BaKO和HFD喂养小鼠中给予维替泊芬，监测肿瘤生长，并检测脂肪组织中BECN1和YAP表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | 548-62-9 | |
| 离心过滤器 | Merk | C7715 | |
| 细胞活力检测 | MTT实验试剂盒 | Invitrogen | M6494 |
| 药物处理 | 维替泊芬 | USP | 129497-78-5 |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 玉米油 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 含DAPI的Fluoroshield封片剂 | Sigma-Aldrich | F6057 |
| Axio Observer Z1/7荧光显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| LSM980共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| Western blot | 抗BECN1抗体 | Cell Signaling Technology | 3738 |
| 抗BECN1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-48341 | |
| 抗FASN抗体 | Cell Signaling Technology | 3180 | |
| 抗PPARγ抗体 | Cell Signaling Technology | 2435 | |
| 抗PLIN1抗体 | Cell Signaling Technology | 9349 | |
| 抗actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| 抗LC3抗体 | Sigma-Aldrich | L8918 | |
| 抗p62抗体 | Abnova | H00008878-M01 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-48341 | |
| 抗β-catenin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | |
| 抗YAP/TAZ抗体 | Santa Cruz | sc-101199 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 抗TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 4883 | |
| 抗磷酸化YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 13008 | |
| 抗LCN2抗体 | R&D Systems | AF1857 | |
| 抗HSL抗体 | Cell Signaling Technology | 4107 | |
| 抗磷酸化HSL抗体 | Cell Signaling Technology | 4137 | |
| 抗磷酸化HSL抗体 | Cell Signaling Technology | 4139 | |
| 抗磷酸化HSL抗体 | Cell Signaling Technology | 45804 | |
| 抗MOB1A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393212 | |
| 抗磷酸化MOB1抗体 | Cell Signaling Technology | 8699 | |
| 抗MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 3682 | |
| 山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP | GenDEPOT | SA001 | |
| 山羊抗兔IgG(H+L)-HRP | GenDEPOT | SA002 | |
| 兔抗山羊IgG(H+L)-HRP | GenDEPOT | SA007 | |
| 免疫荧光 | 抗BECN1抗体 | Cell Signaling Technology | 3738 |
| 抗BECN1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-48341 | |
| 抗PLIN1抗体 | Cell Signaling Technology | 9349 | |
| 抗β-catenin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | |
| 抗YAP/TAZ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101199 | |
| 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 抗TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 4883 | |
| 荧光基团偶联二抗 | Invitrogen | A32744 | |
| 荧光基团偶联二抗 | Invitrogen | A21206 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 逆转录 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 |
| ELISA | 游离脂肪酸ELISA试剂盒 | Abcam | ab65341 |
| 脂肪因子检测 | 小鼠脂肪因子阵列试剂盒 | R&D Systems | ARY013 |
| LEGENDplex多因子检测试剂盒 | Biolegend | 740929 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双报告基因荧光素酶检测系统 | Promega | E1910 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000001 |
| 聚brene | Merk | TR-1003-G | |
| siRNA敲低 | siATG7 | Santa Cruz | SC-29797 |
| siBECN1 | Santa Cruz | SC-41447 | |
| 共培养 | 共培养小室 | SPL | 209260 |
| 共培养小室 | SPL | 37006 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BaKO小鼠肿瘤模型 | 小鼠品系背景、性别（雄性用于MC-38，雌性用于EO771）、年龄（6-8周）、细胞接种数量（5×10^5）和注射部位（皮下或乳腺脂肪垫） 阅读提示：Methods: Animals 和 Syngeneic and xenograft models 小节；Fig. 1a, b 图注 |
| BECN1缺陷脂肪细胞与癌细胞共注射 | imSVC来源、分化方案、4-OHT处理条件（500 nM, 48 h）、4T1细胞与脂肪细胞比例（1:1）及注射细胞数量 阅读提示：Methods: 4T1 cells and differentiated imSVCs 共注射部分；Fig. 1g 图注 |
| 维替泊芬治疗实验 | 给药剂量（30 mg/kg vs 50 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（隔日 vs 每日）和开始治疗时的肿瘤体积 阅读提示：Methods: Drug treatment；Fig. 7d, g 图注 |
| HFD喂养实验 | HFD成分（60 kcal%脂肪）、喂养时长（12周）和开始喂养时小鼠年龄 阅读提示：Methods: Animals 中HFD描述；Fig. 7e 图注 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | LCN2启动子片段、TEAD结合位点、重组YAP1蛋白用量（1 μg）和处理时间（48 h） 阅读提示：Methods: Dual-luciferase reporter assay；Fig. 6j, k 图注 |