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        Diphthamide缺陷促进eEF2与p53结合诱导p21表达并导致神经嵴缺陷

        Diphthamide deficiency promotes association of eEF2 with p53 to induce p21 expression and neural crest defects.

        作者信息Yu Shi, Daochao Huang, Cui Song, Ruixue Cao, Zhao Wang, Dan Wang, Li Zhao, Xiaolu Xu, Congyu Lu, Feng Xiong, Haowen Zhao, Shuxiang Li, Quansheng Zhou, Shuyue Luo, Dongjie Hu, Yun Zhang, Cui Wang, Yiping Shen, Weiting Su, Yili Wu, Karl Schmitz, Shuo Wei, Weihong Song
        PMID38671004
        期刊Nat Commun
        发布时间2024-04-26
        DOI10.1038/s41467-024-47670-1
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含患者样本、敲入小鼠、爪蟾胚胎及U251细胞等多层级模型，并有功能验证和机制验证

        主要模型

        DEDSSH1患者淋巴母细胞样细胞系 Dph1E237Q/Q41X敲入小鼠胚胎 Dph1敲低的X. tropicalis胚胎 U251胶质母细胞瘤细胞

        重点核对

        患者及家系成员DPH1突变经Sanger测序验证，患者淋巴母细胞中diphthamide修饰eEF2降低>50% Dph1E237Q/Q41X敲入小鼠在E10.5体长减小，E14.5–15.5出现腭板融合缺陷，Meckel软骨缩短 X. tropicalis胚胎中dph1 gRNA/Cas9敲低效率经Western blot和Sanger测序验证 U251细胞中DPH1 KO或KD后p21和PUMA的蛋白/mRNA升高，pH3降低 Dph1E237Q/Q41X;p21+/-小鼠部分挽救体长和腭板融合缺陷

        摘要

        Diphthamide是真核翻译延伸因子2（eEF2）特有的修饰组氨酸残基，这种进化上保守的修饰缺失通过未知机制导致发育缺陷。在一名携带Diphthamide生物合成1（DPH1）复合杂合突变且eEF2 diphthamide修饰受损的患者中，我们观察到神经嵴（NC）衍生组织的多种缺陷。携带患者突变的敲入小鼠和Dph1敲低的非洲爪蟾胚胎也表现出NC缺陷，这可归因于神经上皮增殖减少。DPH1敲低促进eEF2从核糖体解离并与p53结合，从而促进细胞周期抑制因子p21的转录，导致增殖受抑。敲除一个p21等位基因可挽救携带患者突变的敲入小鼠的NC表型。这些发现揭示了eEF2作为p53转录共激活因子诱导p21表达和NC缺陷的意外作用，且该作用受diphthamide修饰调控。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        diphthamide修饰缺陷导致发育缺陷及DEDSSH综合征的分子机制是什么？
        核心机制
        DPH1功能缺失减少eEF2的diphthamide修饰，促使eEF2从核糖体转移至细胞核并与p53结合，增强p53对p21和PUMA启动子的结合，诱导p21表达，抑制神经上皮细胞增殖，导致神经嵴缺陷。
        主要证据
        患者淋巴母细胞中diphthamide修饰eEF2降低；Dph1敲低爪蟾胚胎和Dph1E237Q/Q41X敲入小鼠均显示神经上皮增殖减少和神经嵴标志物降低；U251细胞中DPH1 KO/KD增加eEF2-p53结合及p53在p21/PUMA启动子的富集；敲除一个p21等位基因部分挽救敲入小鼠的体长和腭板缺陷。
        研究意义
        揭示eEF2作为p53转录共激活因子诱导p21表达和神经嵴缺陷的新机制，为diphthamide缺陷所致DEDSSH的病理生理提供见解。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        患者突变鉴定与DPH1功能验证

        确定患者DPH1突变及其对diphthamide修饰的影响

        全外显子测序鉴定DPH1复合杂合突变c.136C>T(p.Q46X)和c.724G>C(p.E242Q)；Sanger测序验证家系；构建患者淋巴母细胞样细胞，Western blot检测eEF2总量、diphthamide修饰eEF2和DPH1蛋白；在DPH1-KO HEK293T细胞中过表达野生型或突变型DPH1检测挽救diphthamide修饰的能力。

        2

        Xenopus胚胎中DPH1敲低及神经嵴/增殖表型分析

        验证DPH1缺失对神经嵴和神经上皮增殖的影响

        在X. tropicalis胚胎中注射dph1 gRNA/Cas9或翻译阻断吗啉代寡核苷酸，检测NC标志物表达和pH3标记的增殖细胞；共注射eEF2野生型或G717R突变体进行挽救实验。

        3

        Dph1敲入小鼠构建及表型分析

        验证患者DPH1突变在体内导致DEDSSH样表型

        构建Dph1 c.121C>T(p.Q41X)和c.709G>C(p.E237Q)单突变敲入小鼠，杂交获得Dph1E237Q/Q41X复合杂合小鼠；分析胚胎体长、pH3和SOX10免疫组化、腭板融合及Meckel软骨长度。

        4

        eEF2-p53相互作用及p53靶基因调控机制解析

        阐明diphthamide缺陷如何影响eEF2定位及p53转录活性

        在U251细胞中DPH1 KO或siRNA KD，检测p21、PUMA、p53等蛋白和mRNA；Co-IP检测eEF2与p53结合；细胞组分分离检测eEF2在核糖体、胞质和核内的分布；ChIP-qPCR检测p53在p21和PUMA启动子的结合。

        5

        p21敲除挽救实验

        验证p21升高是否介导DEDSSH表型

        构建p21杂合敲除小鼠，与Dph1E237Q/Q41X小鼠杂交，分析E15.5胚胎体长和腭板融合情况。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        基因突变鉴定与验证
        全外显子测序Sanger测序
        验证分子表达与修饰变化
        Western blot逆转录定量PCR
        验证细胞功能变化
        免疫组织化学原位杂交细胞增殖实验TUNEL实验
        验证机制链路
        共免疫沉淀染色质免疫沉淀-qPCR细胞组分分离
        基因编辑与敲低
        CRISPR/Cas9siRNA敲低吗啉代寡核苷酸敲低
        评估体内表型
        H&E染色阿尔新蓝/茜素红染色

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        原位杂交探针转录MAXIscript T7转录试剂盒Invitrogen--
        Western blot/IHC/IP兔抗OVCA1/DPH1抗体Abcamab185960
        Western blot/IHC兔抗DPH1抗体Lifespan BioscienceLS-C116434
        兔抗eEF2抗体Cell Signaling Technology2332
        免疫沉淀兔抗eEF2抗体Proteintech20107-1-AP
        Western blot兔抗磷酸化eEF2 (Thr56)抗体Cell Signaling Technology2331
        免疫沉淀鼠抗HA抗体AbclonalAE008
        Western blot兔抗HA抗体Cell Signaling Technology3724
        免疫组织化学兔抗Sox10抗体Cell Signaling Technology89356
        Western blotHRP标记抗β-actin抗体BiodragonBD-PB3508
        Western blot/IHC兔抗磷酸化组蛋白H3抗体Cell Signaling Technology53348
        Western blot兔抗组蛋白H3 (Ser10)抗体Proteintech17168-1-AP
        兔抗p53抗体Proteintech10442-1-AP
        鼠抗p53抗体Cell Signaling Technology488185
        兔抗p21抗体Proteintech103551-1-AP
        兔抗p21抗体AbclonalA19094
        兔抗PUMA抗体Proteintech55120-1-AP
        Western blot/IHC兔抗caspase3抗体Proteintech19677-1-AP
        兔抗cleaved caspase3 (Asp175)抗体Cell Signaling Technology9661
        Western blot兔抗lamin B1抗体Proteintech12987-1-AP
        兔抗S6核糖体蛋白抗体Cell Signaling Technology2217
        HRP标记山羊抗兔IgGBeyotimeA0208
        免疫组织化学Cy3标记山羊抗兔IgGBeyotimeA0516
        敲入小鼠构建mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra试剂盒Ambion--
        MEGAclear试剂盒Invitrogen--
        MEGAshortscript试剂盒Invitrogen--
        爪蟾胚胎操作TranscriptAid T7试剂盒Thermo ScientificK0441
        Cas9蛋白PNA Bio--
        细胞培养Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Invitrogen--
        细胞计数细胞计数板Bio-Rad1450015
        细胞裂解RIPA裂解液Thermo Scientific89901
        Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物Thermo Scientific78440
        免疫沉淀Pierce交联磁珠免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒Thermo Scientific88805
        细胞裂解蛋白酶抑制剂BeyotimeP1005
        染色质免疫沉淀SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒Cell Signaling Technology9003
        RNA提取RNeasy Mini试剂盒Qiagen--
        逆转录RevertAid逆转录试剂盒Thermo ScientificK1691
        RT-qPCRRotor-Gene SYBR Green试剂盒Qiagen--
        DNA提取DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒Qiagen--
        淋巴细胞分离淋巴细胞分离液TBD ScienceLTS1077

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        患者样本与突变验证
        患者DPH1突变位点c.136C>T(p.Q46X)和c.724G>C(p.E242Q)，家系成员基因型，淋巴母细胞diphthamide修饰eEF2降低>50%
        阅读提示：Fig. 1c–h及Methods中淋巴细胞分离与Western blot部分
        爪蟾胚胎敲低与表型
        gRNA序列、注射剂量（1 ng Cas9蛋白+300 pg gRNA）、注射阶段（2细胞期单卵裂球）、检测阶段（~15）、谱系示踪剂
        阅读提示：Fig. 2及Methods中X. tropicalis embryo manipulation部分
        敲入小鼠表型分析
        小鼠突变位点c.121C>T(p.Q41X)和c.709G>C(p.E237Q)、遗传背景C57BL/6J、检测胚胎阶段E10.5/E14.5/E15.5、样本量
        阅读提示：Fig. 3及Methods中Generation of Dph1 KI mice和Mouse craniofacial cartilage and bone characterization部分
        U251细胞中DPH1 KO/KD及机制实验
        DPH1 KO的CRISPR靶序列、PE毒素筛选浓度100 nM、siRNA序列、Co-IP和ChIP-qPCR抗体及n=3独立实验
        阅读提示：Fig. 4及Methods中Cell line generation and maintenance、IP、ChIP-qPCR部分
        p21敲除挽救实验
        p21 KO小鼠构建策略（删除Exon 2）、与Dph1E237Q/Q41X杂交、E15.5胚胎体长和腭板融合比例
        阅读提示：Fig. 5及Methods中Generation of p21 KO mice部分

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