球形滋养层类器官的生成
建立具有外层ST细胞层的球形类器官，模拟绒毛ST外层结构。
将TS细胞接种于琼脂糖微孔板，依次用PreM、W-DM、S-DM培养，形成球形类器官，并通过免疫染色检测SDC1、CGB、E-cadherin等标志物。
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基于滋养层干细胞的类器官模型模拟人胎盘屏障
Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.
实验完整度
高包含TS细胞体外类器官、柱式屏障模型、TEER/hCG功能验证、化合物渗透性检测及HUVEC共培养多种证据层级。
主要模型
人滋养层干细胞（TS细胞）系CT27、CT29、CT30 琼脂糖微孔板培养的球形滋养层类器官 柱式合体滋养层（ST）屏障模型 ST/HUVEC共培养屏障模型
重点核对
TS细胞经PreM、W-DM、S-DM三步培养形成外层ST细胞覆盖的球形类器官 柱式ST屏障模型通过TEER值评估屏障完整性 通过hCG分泌量确认ST细胞分化和成熟 FITC-dextran（4 kDa和70 kDa）渗透实验验证屏障功能 抗炎药、咖啡因和草甘膦的Papp值测定验证化合物转运
摘要
人胎盘绒毛在产生激素、介导营养物质和废物交换以及保护胎儿免受外源物质暴露方面具有重要作用。能够重现绒毛结构的人滋养层类器官可为理解胎盘发育和外源物质经胎盘转运提供重要的体外工具。然而，此类类器官目前尚不存在。本文中，我们描述了利用人滋养层干（TS）细胞生成滋养层类器官的方法。在三类培养基处理后，TS细胞形成球形类器官，其外层为单层合体滋养层（ST）细胞，并表现出屏障功能。此外，我们基于滋养层类器官的培养条件开发了一种柱式ST屏障模型。柱底膜几乎完全被syndecan 1阳性的ST细胞覆盖。通过测量跨上皮/跨内皮电阻（TEER）和人绒毛膜促性腺激素的量，确认了模型的屏障完整性和成熟水平。进一步分析表明，该模型可用于推导模型化合物的表观渗透系数。除了为胎盘发育研究提供一套工具外，我们的滋养层模型还可用于评估化合物的转运和毒性，这将促进药物开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用人TS细胞构建模拟人胎盘绒毛ST外层结构的类器官和柱式屏障模型，并用于评估化合物经胎盘转运？
- 核心机制
- TS细胞在琼脂糖微孔中经三步培养基处理形成外层ST细胞层；ST细胞由底层未分化TS细胞补充，维持屏障稳定性；柱式模型中ST细胞在胶原膜上融合形成单层屏障。
- 主要证据
- 球形类器官中SDC1/CGB阳性ST外层、GFP/KSB融合实验、TEEM和hCG检测；柱式模型中TEER升高、hCG分泌增加、FITC-dextran 70 kDa几乎不透过；抗炎药、咖啡因和草甘膦的Papp值与ex vivo灌注趋势相似。
- 研究意义
- 为研究胎盘发育、外源物质经胎盘转运和毒性评估提供体外工具，有助于药物开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ST细胞融合的验证
证明球形类器官外层ST细胞由TS细胞融合形成。
混合GFP-TS细胞和KSB-TS细胞生成类器官，荧光显微镜观察黄色融合细胞；F-actin染色和透射电镜观察多核区域。
柱式ST屏障模型的建立与条件优化
构建可定量测量TEER和渗透性的柱式胎盘屏障模型。
在胶原膜柱式插入物上接种TS细胞，比较四种培养基更换方案，选择最优方案；通过TEER和SDC1免疫染色评估ST覆盖和屏障完整性。
改进ST覆盖率的屏障模型
使柱底膜几乎完全被ST细胞覆盖。
在包被液中加入纤连蛋白，改用含2 μM forskolin的S-DM2，缩短培养至6天，用SDC1-GFP TS细胞和免疫染色确认覆盖率。
屏障功能与化合物渗透性评估
验证模型屏障完整性和用于化合物渗透性分析的可行性。
测量TEER和hCG分泌；进行FITC-dextran渗透实验；用HPLC或LC-MS/MS测定抗炎药、咖啡因和草甘膦的Papp值。
ST/HUVEC共培养屏障模型
增加内皮成分以更好模拟人胎盘屏障。
在TS细胞接种后第2天，于柱内侧接种GFP-HUVEC，继续三步培养，检测TEER和化合物渗透性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | iMatrix-511 | -- | -- |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 人纤连蛋白 | Promo Cell | -- | |
| 屏障模型构建 | ad-MED Vitrigel 2 24孔板 | Kanto chemical co., Inc. | -- |
| 免疫荧光染色 | PE标记抗SDC1抗体（克隆44F9） | Miltenyi Biotec | -- |
| 抗CDH1抗体（#24E10） | Cell Signaling Technology | 24E10 | |
| 抗CDH1抗体（克隆SHE78-7）（#M126） | Takara | M126 | |
| 抗CGB抗体（#IR508） | Dako | IR508 | |
| 抗GATA3抗体（#5852） | Cell Signaling Technology | 5852 | |
| 抗TP63抗体（#ab124762） | Abcam | ab124762 | |
| 抗Ki-67抗体（#M7240） | Dako | M7240 | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG（#4412） | Cell Signaling Technology | 4412 | |
| Alexa Fluor 555标记抗小鼠IgG（#4409） | Cell Signaling Technology | 4409 | |
| Alexa Fluor 647标记抗兔IgG（#4414） | Cell Signaling Technology | 4414 | |
| Hoechst 33258 | Dojindo | -- | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | -- | |
| 鬼笔环肽-FITC | -- | -- | |
| hCG检测 | ELISA试剂盒（#KA4005） | Abnova | KA4005 |
| IgG/IgA摄取实验 | 人血清IgG-FITC（#F9636） | Merck | F9636 |
| FITC标记ChromPure人IgA（#099-090-011） | Jackson Immuno Research | 099-090-011 | |
| FITC-dextran渗透实验 | FITC-葡聚糖（4 kDa和70 kDa） | Sigma Aldrich | -- |
| 化合物转运分析 | 安替比林 | Fujifilm Wako chemicals | -- |
| 草甘膦 | Fujifilm Wako chemicals | -- | |
| TEER测量 | 上皮伏特欧姆计（EVOM）2 | World Precision Instruments | -- |
| STX2 Chopstick电极 | World Precision Instruments | -- | |
| 荧光定量 | SpectraMax Gemini XPS荧光微板阅读器 | -- | -- |
| HPLC分析 | Agilent 1200高效液相色谱仪 | Agilent Technologies | -- |
| LC-MS/MS分析 | AB Sciex TripleTOF 5600+质谱仪 | AB Sciex | -- |
| InertSustain Amide色谱柱 | GL Sciences Inc. | -- | |
| 显微镜观察 | BZ-X800/810全自动显微镜 | Keyence | -- |
| 共聚焦显微镜观察 | Zeiss LSM 700共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 电子显微镜观察 | JEM-1400Flash透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 扫描电子显微镜观察 | JSM-7900F扫描电子显微镜 | JEOL | -- |
| 临界点干燥 | JCPD-5临界点干燥仪 | JEOL | -- |
| 冷冻切片 | Leica CM1950冷冻切片机 | Leica | -- |
| Tissue-Tek Polar-D冷冻切片机 | -- | -- | |
| 电转染 | CUY21Vitro-EX电转染仪 | BEX | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 球形滋养层类器官生成 | TS细胞接种密度、培养基种类及更换时间、S-DM中FBS浓度 阅读提示：Methods中“Generation of spherical trophoblast organoids”小节及Fig. 1A |
| 柱式ST屏障模型建立 | 胶原膜包被条件、TS细胞接种密度、三步培养基及培养天数 阅读提示：Methods中“Generation of ST barrier models”小节及Fig. 3D |
| 改进ST覆盖率 | 纤连蛋白浓度、S-DM2中forskolin浓度、培养总天数 阅读提示：Methods中“Generation of ST barrier models”改进部分及Fig. 4B |
| ST/HUVEC共培养 | HUVEC接种密度和接种时间、HUVEC培养基 阅读提示：Methods中“Generation of ST barrier models”共培养部分及Fig. 5A |
| 化合物渗透性分析 | 化合物浓度、孵育时间、检测方法（HPLC/LC-MS/MS） 阅读提示：Methods中“Translocation analysis”和“HPLC analysis”“LC-MS/MS”小节 |