逐步CRISPR敲除筛选鉴定候选基因
鉴定能赋予CD8+ T细胞TGFβ抗性并增强抗肿瘤功能的基因
先在HT2细胞中进行全基因组CRISPR KO筛选（IL2 vs input、IL2+TGFβ1 vs IL2），筛选出256个候选基因；再在Cas9/OT-I原代CD8+ T细胞中进行体内bulk筛选（肿瘤、脾、TDLN），随后进行单细胞CRISPR筛选。
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CUL5 E3连接酶复合物负向调控CD8+ T细胞的核心信号通路
The CUL5 E3 ligase complex negatively regulates central signaling pathways in CD8+ T cells.
实验完整度
高结合体外全基因组筛选、体内bulk及单细胞CRISPR筛选、蛋白质组学、co-IP、小鼠ACT模型及人原代CD8+ T细胞功能验证
主要模型
HT2小鼠T细胞系 Cas9/OT-I小鼠原代CD8+ T细胞 E.G7-OVA肿瘤小鼠ACT模型 人原代CD8+ T细胞及CD19 CAR-T细胞
重点核对
CUL5 KO效率：通过MS、Western blot及流式检测CUL5蛋白水平确认 体内ACT模型：E.G7-OVA肿瘤细胞皮下接种C57BL/6N小鼠，亚致死剂量4 Gy照射后回输T细胞 体内分组与样本量：CUL5 KO组5只、NC组6只小鼠，每组4个重复用于筛选富集分析 体外刺激条件：1 µg/ml板包被anti-CD3e和1 µg/ml可溶性anti-CD28，检测6 h和16 h效应分子 Neddylation抑制：250 nM TAS4464处理，检测GZMB和IFNg表达
摘要
CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，更好地理解其调控机制可推动癌症免疫疗法的发展。本文通过逐步CRISPR筛选鉴定出CUL5是CD8+ T细胞核心信号通路的负调控因子。在小鼠CD8+ T细胞中敲除CUL5可显著增强其抑制肿瘤生长的能力，并伴随广泛的蛋白质组改变，从而增强TCR和细胞因子信号传导及其效应功能。对CUL5激活所需的neddylation进行化学抑制也能增强CD8效应活性，并验证CUL5为主要靶点。机制上，受TCR刺激上调的CUL5与含SOCS-box的蛋白PCMTD2相互作用，抑制TCR和IL2信号传导。此外，CUL5敲除显著上调CTLA4，其失活进一步增强CUL5 KO的抗肿瘤效果。这些结果共同揭示了CD8+ T细胞的负调控机制，并在癌症免疫治疗中具有重要的转化意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD8+ T细胞中调控抗肿瘤效应功能和TCR/细胞因子信号的关键负调控因子是什么，其机制如何？
- 核心机制
- 受TCR刺激上调并发生neddylation的CUL5与含SOCS-box的衔接蛋白PCMTD2相互作用，通过泛素化降解CD247和IL2RB等底物，负向调控TCR和IL2/STAT5信号通路及效应功能。
- 主要证据
- 逐步CRISPR筛选鉴定CUL5；CUL5 KO增强小鼠和人CD8+ T细胞体外杀伤及体内抗肿瘤效果；DIA-MS显示TCR/IL2信号和效应分子上调；co-IP-MS和co-IP证实CUL5-PCMTD2相互作用及对CD247/IL2RB的泛素化降解。
- 研究意义
- 揭示了CD8+ T细胞的负调控机制，CUL5 KO或neddylation抑制联合CTLA4阻断在过继细胞治疗和癌症免疫治疗中具有转化潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CUL5 KO增强CD8+ T细胞体内抗肿瘤效果
验证CUL5敲除对原代CD8+ T细胞体内抗肿瘤能力的影响
将CUL5 KO或NC的Cas9/OT-I T细胞回输至亚致死剂量照射的E.G7-OVA荷瘤小鼠，监测肿瘤生长和生存，检测肿瘤浸润T细胞的IL7R、GZMB、IFNg/TNFa产生及TDLN转移。
CUL5 KO增强CD8+ T细胞体外效应功能
验证CUL5敲除对细胞因子诱导分化和TCR依赖活化的影响
在IL2/IL7/IL15细胞因子 cocktail中扩增分化CUL5 KO和NC T细胞，anti-CD3/CD28刺激6 h和16 h（±TGFβ1），流式检测GZMB和IFNg，ELISA检测分泌IFNg，并与E.G7-OVA共培养进行杀伤实验。
蛋白质组学分析CUL5 KO的分子改变
揭示CUL5调控CD8+ T细胞功能的蛋白质组机制
对CUL5 KO和NC原代CD8+ T细胞在T0（细胞因子扩增）、T8（撤因子8 h）、T16（撤因子8 h后TCR刺激16 h）三个条件进行DIA-MS总蛋白定量，并用流式验证关键标志物。
鉴定CUL5相互作用蛋白及底物
确定CD8+ T细胞中CUL5的底物受体和直接底物
在原代CD8+ T细胞中过表达CUL5-HA，TCR刺激12 h后anti-HA免疫沉淀并进行DIA-MS；通过co-IP验证CUL5-PCMTD2相互作用；在HEK293T中共表达CUL5、PCMTD2和GFP-CD247/IL2RB进行泛素化实验；TUBES pull-down结合LC-MS检测CUL5 KO后泛素化变化。
Neddylation抑制验证CUL5特异性
验证neddylation对CD8+ T细胞效应功能的调控是否主要依赖CUL5
在CUL5 KO和NC CD8+ T细胞中分别加入TAS4464或MLN4924，检测细胞因子培养和TCR刺激条件下GZMB和IFNg表达。
人CD8+ T细胞和CAR-T验证及CTLA4联合KO
评估CUL5调控的人相关性和CTLA4/CUL5双敲除的治疗潜力
在人原代CD8+ T细胞中电转RNP敲除CUL5，检测GZMB和IFNG；构建CD19 CAR-T，检测对NALM6的杀伤和重复刺激后活性；在小鼠E.G7-OVA模型中比较NC、CTLA4 KO、CUL5 KO和CTLA4/CUL5 DKO的体内抗肿瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR文库筛选 | Brie全基因组小鼠CRISPR敲除文库 | Addgene | 73632 |
| 慢病毒包装 | pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| 逆转录病毒包装 | pCL-Eco包装质粒 | Addgene | 12371 |
| sgRNA载体构建 | pMSCV-sgRNA载体 | Addgene | 102796 |
| CAR构建 | CD19 CAR质粒 | Addgene | 135992 |
| 基因组DNA提取 | DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| CD8+ T细胞分离 | CD8+ T细胞分离试剂盒 | MACS | 130-104-075 |
| T细胞激活 | 抗小鼠CD3/CD28磁珠 | Thermo Scientific | 11456D |
| NGS PCR | NEBNext Ultra II Q5预混液 | NEB | M0544S |
| PCR产物纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63880 |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics 3’ V2单细胞RNA测序试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| RNP核转染 | Cas9蛋白 | IDT | 1081058 |
| tracrRNA | IDT | 1072532 | |
| 增强子DNA | IDT | 1075915 | |
| 细胞因子培养 | 人白介素-2 | R&D | 202-IL-010 |
| 小鼠白介素-7 | Peprotech | 217-17 | |
| 小鼠白介素-15 | Peprotech | 500-P173 | |
| 人白介素-7 | R&D | 207-IL-005 | |
| 人白介素-15 | R&D | 247-IL-005 | |
| T细胞刺激 | 抗小鼠CD3e抗体 | Biolegend | 100340 |
| 抗小鼠CD28抗体 | Biolegend | 102116 | |
| 抗人CD3/CD28磁珠 | Thermo Scientific | 11131D | |
| 蛋白质转运阻断 | 转运体阻断剂 | Thermo Scientific | 00-4980-03 |
| Neddylation抑制 | TAS4464 | Selleckchem | S8849 |
| 细胞标记 | CFSE | Thermo Scientific | C34554 |
| CellTrace紫 | Thermo Scientific | C34557 | |
| RNA提取 | RNeasy plus mini试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| 逆转录 | iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | 1708841 |
| RT-qPCR | SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725270 |
| ELISA | 小鼠IFNg ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | KMC4021 |
| 流式细胞术 | 抗CD16/32抗体 | BD | 553142 |
| 可固定水溶性活/死染料 | Thermo Scientific | L34957 | |
| 1x透化缓冲液 | Thermo Scientific | 00-833356 | |
| 兔多克隆抗CUL5抗体 | Thermo Scientific | A302-173A | |
| 抗pERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗兔IgG-PE二抗 | Thermo Scientific | P-2771MP | |
| 抗兔IgG-Alexa Fluor 350二抗 | Thermo Scientific | A-11069 | |
| 蛋白质组学 | cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11697498001 |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀裂解缓冲液 | Thermo Scientific | 87787 |
| 抗HA抗体 | Biolegend | 901515 | |
| Protein G磁珠 | Thermo Scientific | 10003D | |
| TUBES pull-down | 串联泛素结合实体 | LifeSensors | UM-0501M-1000 |
| 人CD8+ T细胞分离 | 人CD8+ T细胞分离试剂盒 | MACS | 130-094-156 |
| Western blot | 抗CUL5抗体 | Thermo Fisher | A302-173A |
| 抗PCMTD2抗体 | Thermo Fisher | PA5-69557 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗Hsp90抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 抗HA抗体 | Biolegend | 901513 | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗GFP抗体 | Santa Cruz | sc-9996 | |
| 2x SDS上样缓冲液 | Thermo scientific | NP0007 | |
| 细胞培养 | NALM6 B细胞系 | ATCC | CRL-3273 |
| 流式细胞术 | SIINFEKL-H-2K(b)四聚体-BV421 | NIH Tetramer Core Facility | 53995 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内bulk CRISPR筛选 | 肿瘤细胞接种量3×106、T细胞回输量2×106/只、4 Gy照射、4个重复、回输后12天分选 阅读提示：Methods中In vivo bulk CRISPR KO screening小节 |
| CUL5 KO体内抗肿瘤验证 | E.G7-OVA模型、4 Gy亚致死照射、1×106 T细胞回输、CUL5 KO组5只和NC组6只、每两天监测 阅读提示：Methods中In vivo gene KO validation小节及Fig. 2图注 |
| 体外T细胞刺激与效应检测 | 细胞因子浓度（5 ng/ml hIL2、2.5 ng/ml mIL7、25 ng/ml mIL15）、1 µg/ml anti-CD3e和anti-CD28、6 h和16 h时间点、±TGFβ1 阅读提示：Methods中In vitro CD8+ T cell stimulation小节及Fig. 3图注 |
| DIA-MS蛋白质组学 | T0/T8/T16三个条件、每组n=3、差异蛋白cutoff p<0.01且FC>1.8或<0.55、TCR刺激16 h 阅读提示：Methods中Proteomics analysis小节及Fig. 4图注 |
| CUL5-PCMTD2相互作用与泛素化 | CUL5-HA过表达、TCR刺激12 h、MG-132 10 µM最后8 h、co-IP-MS cutoff p<0.05且Log2FC>0.66 阅读提示：Methods中Proteomics analysis and co-IP for mass spectrometry小节及Fig. 5图注 |
| Neddylation抑制实验 | TAS4464浓度250 nM、MLN4924浓度文中未明确说明、细胞因子培养或TCR刺激条件、每组n=3 阅读提示：Methods中In vitro CD8+ T cell stimulation小节及Fig. 5h,i图注 |
| 人原代CD8+ T细胞和CAR-T实验 | 2×106细胞电转EO-115程序、CAR-T与NALM6按1:2共培养、IL2/IL7/IL15浓度、每组n=3 阅读提示：Methods中Human T cell culture and manipulation小节及Fig. 6图注 |
| CTLA4/CUL5双敲除体内实验 | 每组n=4-5、CTLA4 KO通过RNP核转染、E.G7-OVA模型、4 Gy照射 阅读提示：Methods中In vivo gene KO validation小节及Fig. 4i图注 |