验证UPF1与LIN28A直接相互作用
确认UPF1和LIN28A是否以RNA非依赖方式直接结合
在293T细胞中共表达FLAG-LIN28A与GST-MYC-UPF1并进行IP，在核酸酶存在或缺失条件下检测复合物；用纯化GST-MYC-UPF1与His-LIN28A进行体外GST pull-down；在PA-1和hPSCs中进行PLA和共聚焦共定位
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多能干细胞早期分化过程中UPF1-LIN28A相互作用的作用
Role of UPF1-LIN28A interaction during early differentiation of pluripotent stem cells.
实验完整度
高包含体外重组蛋白结合、细胞系IP/PLA、肽设计SPR、hPSCs RNA-seq及三胚层分化功能验证
主要模型
HeLa细胞 PA-1细胞 hPSCs（CHA15、H9、Pro2） 293T细胞
重点核对
CPP-P8在hPSCs中处理浓度为10 μM，含肽培养基每日更换，处理5天或10天 CPP偶联肽在HeLa、293T、PA-1细胞中处理浓度为2 μM，处理12 h siRNA转染hPSCs为100 nM、PA-1细胞为50 nM NMD效率以含PTC转录本与无PTC转录本的相对丰度比值计算，以MUP mRNA为参考 PLA信号仅在同时使用anti-UPF1和anti-LIN28A抗体时于40 nm内出现
摘要
UPF1和LIN28A是参与转录后调控和干细胞分化的RNA结合蛋白。关于UPF1和LIN28A的研究大多分别聚焦于分化细胞的分子机制和干细胞分化。我们发现，LIN28A在UPF1与UPF2复合之前直接与UPF1相互作用，从而降低UPF1磷酸化并抑制无义介导的mRNA降解（NMD）。我们鉴定了UPF1和LIN28A的相互作用结构域；此外，我们开发了一种肽，可破坏UPF1-LIN28A相互作用并增强NMD效率。对人类多能干细胞（hPSCs）的转录组分析证实，NMD靶标的水平受UPF1和LIN28A的显著调控。使用CPP偶联肽抑制UPF1-LIN28A相互作用，可通过在增殖过程中抑制hPSCs的多能性来促进自发分化。此外，UPF1-LIN28A相互作用特异性调控参与外胚层分化的转录本。我们的研究揭示，hPSCs中通过UPF1-LIN28A相互作用进行的转录组调控决定了细胞命运。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UPF1与LIN28A是否直接相互作用，以及该相互作用如何影响NMD和人多能干细胞的分化命运。
- 核心机制
- LIN28A在UPF1与UPF2复合之前直接结合UPF1，阻碍UPF1-UPF2相互作用，降低UPF1磷酸化并抑制NMD，从而调控hPSCs转录组和细胞命运。
- 主要证据
- 通过293T细胞IP/GST pull-down、纯化蛋白体外结合、PA-1和hPSCs的PLA证实直接相互作用；NMD报告质粒、tethering实验及CHA15细胞RNA-seq证实LIN28A抑制NMD；CPP-P8破坏相互作用后增加p-UPF1、降低多能性标志物并影响外胚层标志物表达。
- 研究意义
- 揭示UPF1-LIN28A相互作用在hPSCs增殖和分化中的关键功能，并提示抑制肽可用于调控hPSCs向特定外胚层组织分化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LIN28A对NMD的抑制作用
确定LIN28A是否影响NMD效率
在HeLa细胞中共转染NMD报告质粒（Gl和GPx1，含正常终止密码子或PTC）与FLAG-LIN28A，检测NMD效率；在PA-1细胞中敲低内源LIN28A并用FLAG-LIN28A回补；进行MS2 tethering实验；对CHA15细胞敲低UPF1或LIN28A后进行RNA-seq
解析LIN28A阻断UPF1-UPF2相互作用及UPF1磷酸化
确定UPF1-LIN28A相互作用影响NMD的分子环节
在293T细胞中共表达MYC-UPF1与GST-LIN28A并检测共沉淀的UPF2；在hPSCs中敲低LIN28A后检测UPF1-UPF2相互作用及UPF1 S1096和T28磷酸化
鉴定相互作用结构域并设计抑制肽
确定UPF1与LIN28A结合结构域并筛选可阻断相互作用的肽
构建系列GST-MYC-UPF1截短体和GST-LIN28A截短体，通过GST pull-down定位相互作用结构域；合成来源于UPF1（419–700）的七条肽及随机对照P1，用SPR检测与His-LIN28A的结合；对P8进行浓度梯度动力学评估
验证CPP-P8阻断UPF1-LIN28A相互作用
确认CPP偶联P8可在细胞内破坏UPF1-LIN28A复合物并影响NMD
合成CPP-P1、CPP-P2、CPP-P8和CPP-FITC；在表达GST-LIN28A和MYC-UPF1的细胞中孵育肽后进行GST pull-down；检测hPSCs中p-UPF1水平；用NMD报告质粒评估CPP-P8对NMD的影响；用PLA检测细胞内复合物
评估UPF1-LIN28A相互作用对hPSCs多能性及转录组的影响
确定该相互作用是否维持hPSCs多能性并调控转录组
用CPP-P8处理CHA15细胞后进行RNA-seq，比较UPF1敲低、LIN28A敲低和CPP-P8处理的共同调控转录本；用荧光显微镜和流式细胞术检测OCT4和NANOG阳性细胞；长期处理观察细胞形态和分化标志物
评估该相互作用对外胚层分化的影响
确定UPF1-LIN28A相互作用是否特异性影响三胚层分化中的外胚层分化
用STEMdiff Trilineage Differentiation Kit将CHA15细胞分化为外胚层、中胚层和内胚层，并在CPP-P8存在下进行RNA-seq；用免疫染色和流式细胞术检测OCT4、SOX1、DLK1和LHX2
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR Plus基础培养基与mTeSR Plus 5X添加剂 | STEMCELL Technologies | 100-0276 |
| 基质胶 | Corning | 354277 | |
| ReLeSR细胞传代试剂 | STEMCELL Technologies | 100-0484 | |
| Accutase细胞解离液 | Merck | SCR005 | |
| Y-27632 ROCK抑制剂 | Tocris Bioscience | -- | |
| 三胚层分化 | STEMdiff三胚层分化试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05230 |
| 质粒构建 | pFLAG载体 | Sigma-Aldrich | -- |
| pGEX-4T-1载体 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| ClaI限制性内切酶 | NEB | R0197 | |
| KpnI限制性内切酶 | NEB | R3142 | |
| XhoI限制性内切酶 | NEB | R0146 | |
| NotI限制性内切酶 | NEB | R0189 | |
| SalI限制性内切酶 | NEB | R0138 | |
| HindIII限制性内切酶 | NEB | R0104 | |
| EcoRI限制性内切酶 | NEB | R0101 | |
| T4 DNA聚合酶 | Cosmogenetech | -- | |
| SPR分析 | His标签LIN28A重组蛋白 | LS-bio | LS-G637 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RQ1无RNase DNase | Promega | -- | |
| RevertAid逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0441 | |
| SensiFAST SYBR No-ROX试剂盒 | Meridian Bioscience | -- | |
| RNA-seq | Quant-IT RiboGreen RNA定量试剂 | Invitrogen | R11490 |
| TapeStation RNA检测胶条 | Agilent | -- | |
| Illumina TruSeq链特异性mRNA建库试剂盒 | Illumina | 20020594 | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 18064022 | |
| KAPA Illumina测序平台文库定量试剂盒 | KAPA BIOSYSTEMS | KR0405 | |
| TapeStation D1000 ScreenTape | Agilent | -- | |
| Illumina NovaSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫共沉淀 | Pierce抗c-Myc磁珠 | Thermo Scientific | 88842 |
| Pierce抗HA磁珠 | Thermo Scientific | 88837 | |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B | Cytiva | GE17-0756-01 | |
| benzonase核酸酶 | Sigma-Aldrich | 70664 | |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | GenScript | A00187 |
| 抗UPF1抗体 | Cell Signaling Technology | 12040 | |
| 抗UPF2抗体 | Cell Signaling Technology | 11875 | |
| 抗eIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 2067 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| 抗GST抗体 | Cytiva | 27-4577-01 | |
| 抗MYC抗体 | Calbiochem | OP10 | |
| 抗Calnexin抗体 | Cell Signaling Technology | 2679 | |
| 抗LIN28A抗体 | Cell Signaling Technology | 3978 | |
| 抗p-Thr28磷酸化UPF1抗体 | ImmuQuest | IQ653 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Invitrogen | 31460 | |
| 山羊抗鼠IgG二抗 | Invitrogen | 31430 | |
| 马抗山羊IgG二抗 | Vector Laboratories | PI-9500 | |
| 邻位连接实验 | Duolink原位红色小鼠/兔试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 抗LIN28A抗体 | Cell Signaling Technology | 5930 | |
| 封片 | 含DAPI的VECTASHIELD封片剂 | Vector Laboratories | H1200 |
| 细胞染色 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 正常山羊血清 | Fitzgerald industries | NG22S | |
| 抗OCT4抗体 | Santa Cruz | sc-5279 | |
| 抗NANOG抗体 | Cell Signaling Technology | 4903 | |
| 抗DLK1抗体 | GeneTex | GTX60511 | |
| 抗SOX1抗体 | Cell Signaling Technology | 4194 | |
| 抗LHX2抗体 | GeneTex | GTX129241 | |
| Cy3二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A-11008 | |
| 流式细胞术 | BD Cytofix固定液 | BD Biosciences Pharmingen | 554655 |
| 成像 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TSC SP5 |
| 免疫荧光显微镜 | Leica | DM5000B | |
| 流式细胞术 | FACSCanto流式细胞仪 | BD Pharmingen | -- |
| Western blot | ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CPP偶联肽处理hPSCs | 肽处理浓度10 μM；含肽培养基每日更换；处理时长5天或10天（长期实验超过15天）；溶剂与对照肽CPP-P1/CPP-P2 阅读提示：Methods“CPP-conjugated peptide treatment”及Fig. 6a图注 |
| CPP偶联肽处理HeLa/293T/PA-1细胞 | 肽浓度2 μM；处理12 h；培养基为含10% FBS的DMEM 阅读提示：Methods“CPP-conjugated peptide treatment” |
| siRNA转染 | hPSCs使用100 nM siRNA，PA-1使用50 nM siRNA；转染试剂Lipofectamine 3000；PA-1采用电转 阅读提示：Methods“siRNA or plasmid DNA transfection” |
| NMD效率检测 | 报告质粒Gl和GPx1含正常终止密码子或PTC；参考质粒MUP；NMD效率为含PTC与无PTC转录本相对丰度比值；独立重复n=5 阅读提示：Methods“Calculation of NMD efficiency”及Fig. 2图注 |
| 三胚层分化 | STEMdiff Trilineage Differentiation Kit；外胚层/内胚层在0、3、5天分析，中胚层在0、3、4天分析；CPP-P8浓度10 μM；仅CHA15细胞用于分化实验 阅读提示：Methods“CPP-conjugated peptide treatment”与“Cell cultivation”、Fig. 7图注及Supplementary Fig. 7 |
| PLA检测UPF1-LIN28A相互作用 | anti-UPF1（1:200）与anti-LIN28A（1:200）；检测40 nm内信号；Duolink In Situ Red kit；独立重复n=3 阅读提示：Methods“Proximity ligation assay”及Fig. 1e、Fig. 5d图注 |
| RNA-seq分析 | 总RNA RIN>7.0；每样本1 μg总RNA建库；Illumina NovaSeq 2×100 bp；参考基因组GRCh37；差异基因分析使用DESeq2或FPKM比值 阅读提示：Methods“RNA sequencing and analysis” |