细胞周期阻滞对铁死亡敏感性的影响
验证细胞周期阻滞是否抑制铁死亡。
用hydroxyurea、thymidine、colcemid、nocodazole或palbociclib处理多种癌细胞系和MEFs，或用CRISPR-Cas9敲除CDK1或RB1，检测erastin或RSL3诱导的PI阳性细胞和脂质过氧化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
细胞周期阻滞诱导脂滴形成并赋予铁死亡抗性
Cell cycle arrest induces lipid droplet formation and confers ferroptosis resistance.
实验完整度
高包含多种细胞系体外实验、慢 cycling 耐药细胞模型、脂质组学及小鼠移植瘤体内验证，并有功能与机制验证。
主要模型
Caki-1肾癌细胞系 HCT116结直肠癌细胞系及5-FU耐药HCT116 FR细胞 T47D乳腺癌细胞系及palbociclib耐药T47D PR细胞 HCT116和HCT116 FR皮下移植瘤 nude 小鼠模型
重点核对
细胞周期抑制剂处理浓度与时间：hydroxyurea 0.3 mM、thymidine 1 mM、colcemid 0.035 μg/ml、nocodazole 200 nM处理48 h（细胞周期分析）或预处理24 h（铁死亡实验） 铁死亡诱导剂处理：erastin 2 μM处理18 h、RSL3 50 nM处理24 h、ML162 10 μM或200 nM处理24 h（因细胞系而异） DGAT抑制剂：T863和PF06427878联合（iDGAT1/2）体外预处理24 h，体内A-922500 3 mg/kg和PF-06427878 2 mg/kg每日两次口服灌胃 体内铁死亡诱导：IKE 30 mg/ml每日腹腔注射；liproxstatin-1 10 mg/kg每日腹腔注射 移植瘤模型：HCT116或HCT116 FR细胞2.5×10^6个混合50% Matrigel皮下植入，肿瘤达200 mm3后随机分组
摘要
细胞如何协调细胞周期与细胞存活和死亡仍不完全清楚。在此，我们展示细胞周期阻滞对铁死亡具有强效抑制作用，铁死亡是一种由细胞膜上过度脂质过氧化诱导的调节性细胞死亡形式。机制上，细胞周期阻滞诱导二酰甘油酰基转移酶（DGAT）依赖性脂滴形成，以将阻滞细胞中积累的过量多不饱和脂肪酸（PUFAs）以三酰甘油（TAGs）形式隔离，从而导致铁死亡抑制。因此，DGAT抑制协调PUFAs从TAGs向磷脂的重新分配，并使阻滞细胞对铁死亡重新敏感。我们展示一些慢 cycling 抗有丝分裂药物耐药癌细胞，如5-氟尿嘧啶耐药细胞，具有脂滴积累，并且铁死亡诱导剂与DGAT抑制剂的联合治疗通过诱导铁死亡有效抑制5-氟尿嘧啶耐药肿瘤的生长。总之，这些结果揭示了细胞周期阻滞在驱动铁死亡抗性中的作用，并提示了一种靶向慢 cycling 治疗耐药癌症的铁死亡诱导治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞周期阻滞是否影响铁死亡敏感性，以及慢 cycling 治疗耐药癌细胞是否因此获得铁死亡抗性。
- 核心机制
- 细胞周期阻滞诱导DGAT依赖性TAG合成和脂滴形成，将过量PUFAs隔离在TAGs中，减少其掺入磷脂和醚磷脂，从而抑制脂质过氧化和铁死亡；DGAT抑制则使PUFAs从TAGs重新分配至磷脂，恢复铁死亡敏感性。
- 主要证据
- 多种细胞系中细胞周期抑制剂或CDK1缺失抑制erastin/RSL3诱导的脂质过氧化和铁死亡；脂质组学显示nocodazole增加TAGs，DGAT抑制增加PUFA-PLs；DGAT抑制剂或基因敲除逆转铁死亡抗性；5-FU耐药、palbociclib耐药和放射耐药细胞脂滴增加且铁死亡抗性增强；IKE与iDGAT1/2联合抑制HCT116 FR移植瘤生长。
- 研究意义
- 揭示细胞周期阻滞驱动铁死亡抗性的作用，并提出铁死亡诱导剂联合DGAT抑制剂治疗慢 cycling 治疗耐药癌症的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞周期阻滞对脂质组成和脂滴的影响
探究细胞周期阻滞是否改变脂质代谢和脂滴积累。
对nocodazole处理的Caki-1细胞进行非靶向脂质组学分析，用BODIPY 493/503染色检测脂滴，用Triglyceride Assay Kit测定TAG水平，并用iDGAT1/2或DGAT1/2基因敲除干预。
DGAT在细胞周期阻滞诱导铁死亡抗性中的作用
验证DGAT介导的TAG合成和脂滴形成是否负责铁死亡抗性。
在细胞周期抑制剂或CDK1缺失条件下，用iDGAT1/2或DGAT1/2基因敲除，检测erastin诱导的PI阳性细胞和脂质过氧化。
慢 cycling 治疗耐药癌细胞的脂滴和铁死亡抗性
验证慢 cycling 治疗耐药癌细胞是否具有脂滴积累和铁死亡抗性。
构建5-FU耐药HCT116 FR、palbociclib耐药T47D PR和放射耐药H460 RR细胞，检测脂滴水平、增殖和铁死亡敏感性，并用iDGAT1/2干预。
铁死亡诱导剂联合DGAT抑制剂的体内疗效
评估联合治疗对5-FU耐药移植瘤生长的抑制作用。
用HCT116和HCT116 FR皮下移植瘤 nude 小鼠模型，给予IKE、iDGAT1/2、liproxstatin-1等处理，测量肿瘤体积和重量，并进行4-HNE、PLIN3和Ki67免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞周期与细胞死亡
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | 26140079 |
| McCoy's 5a培养基 | ATCC | 30-2007 | |
| Eagle最低必需培养基 | ATCC | 30-2003 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Sigma | D6429 | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | R8758 | |
| 牛胰岛素 | Sigma | 91077C | |
| 药物处理 | 羟基脲 | Sigma | H8627 |
| 胸苷 | Sigma | T1895 | |
| 秋水仙酰胺 | Sigma | 234109-M | |
| 诺考达唑 | Sigma | 487929-M | |
| T863 | Sigma | SML0539 | |
| PF06427878 | Sigma | PZ0412 | |
| erastin | Cayman chemical | 17754 | |
| RSL3 | Tocris | 6118 | |
| ML162 | Cayman chemical | 20455 | |
| ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | |
| necrostatin-1s | BioVision | 2263 | |
| Z-VAD-fmk | R&D Systems | FMK001 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165 | |
| 去铁胺 | Sigma | D9533 | |
| 转染与筛选 | hexadimethrine bromide | Millipore | TR-1003-G |
| 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| 诱导敲除 | 多西环素 | Sigma | D9891 |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Roche | 11348639001 |
| EdU流式检测 | Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 488流式检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10632 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11 | Invitrogen | D3861 |
| 脂滴染色 | BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 |
| 甘油三酯测定 | 甘油三酯检测试剂盒 | Abcam | ab65336 |
| 胱氨酸摄取 | [14C]胱氨酸 | PerkinElmer | NEC854010UC |
| 谷胱甘肽测定 | GSH-Glo谷胱甘肽检测 | Promega | V6911 |
| 不稳定铁池检测 | 钙黄绿素-AM | Invitrogen | C3099 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Millipore | 20-188 |
| Bradford检测 | Bio-Rad | 500-0006 | |
| 磷酸化Rb (S780)抗体 | Cell Signaling Technology | 9307 | |
| RB1抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| CDK1抗体 | Cell Signaling Technology | 9116 | |
| ACSL4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271800 | |
| GPX4抗体 | R&D Systems | MAB5457 | |
| SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| FSP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377120 | |
| DHODH抗体 | Proteintech | 14877-1-AP | |
| DGAT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271934 | |
| vinculin抗体 | Sigma | V4505 | |
| tubulin抗体 | Sigma | T9026 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Thermo Scientific | 31460 | |
| 山羊抗鼠IgG二抗 | Proteintech | SA00001-1 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | 18064-014 | |
| SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal | Invitrogen | 11762-500 | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma | V5265 |
| 动物实验 | Matrigel | Corning | 354234 |
| IKE | Kadmon Corporation | -- | |
| liproxstatin-1 | Sigma | SML1414 | |
| A-922500 | Selleckchem | S2674 | |
| PF-06427878 | Sigma | PZ0412 | |
| 免疫组化 | 4-HNE抗体 | Abcam | ab46545 |
| PLIN3抗体 | Abcam | ab47638 | |
| Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9027 | |
| VECTASTAIN Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| DAB过氧化物酶底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞周期阻滞处理 | 细胞周期抑制剂种类、浓度和处理时间：hydroxyurea 0.3 mM、thymidine 1 mM、colcemid 0.035 μg/ml、nocodazole 200 nM处理48 h（细胞周期分析）或预处理24 h（铁死亡实验）；palbociclib 2 μM处理48 h或预处理24 h 阅读提示：Methods细胞培养研究和Cell cycle analysis部分；Fig. 1a, i；Supplementary Table 1 |
| 铁死亡诱导处理 | erastin和RSL3浓度及处理时间因细胞系而异：Caki-1用erastin 2 μM 18 h或RSL3 50 nM 24 h；ACHN用erastin 5 μM 24 h；HT1080用erastin 10 μM 24 h；A375用erastin 20 μM 24 h；MEFs用erastin 2 μM 16 h；ML162浓度见原文 阅读提示：Fig. 1图注；Methods细胞死亡检测和脂质过氧化测定；Supplementary Table 1 |
| DGAT抑制处理 | 体外iDGAT1/2为T863和PF06427878联合，预处理24 h，具体浓度未在正文明确说明；体内A-922500 3 mg/kg和PF-06427878 2 mg/kg每日两次口服灌胃 阅读提示：Methods细胞培养研究和Xenograft experiments；Fig. 3图注；Supplementary Table 1 |
| 移植瘤模型与给药 | HCT116或HCT116 FR细胞2.5×10^6个混合50% Matrigel皮下植入；肿瘤达200 mm3后随机分组；IKE 30 mg/ml每日腹腔注射；liproxstatin-1 10 mg/kg每日腹腔注射；n=6-10每组 阅读提示：Methods Xenograft experiments；Fig. 4k-n图注 |
| 脂滴和脂质过氧化检测 | BODIPY 493/503 2 μM孵育15 min；BODIPY 581/591 C11 5 μM孵育30 min；流式细胞术至少分析5000个单细胞；实验独立重复三次 阅读提示：Methods脂滴染色和脂质过氧化测定；Fig. 2c, d；Fig. 3e-h |