单细胞转录组图谱构建
刻画AM肿瘤生态系统及LN+AM与LN-AM的细胞组成差异。
对12例AM患者原发肿瘤组织进行scRNA-seq，整合分析获得52,382个细胞，注释为13种细胞类型。
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整合单细胞和空间转录组分析描绘肢端黑色素瘤的早期播散机制
Delineating the early dissemination mechanisms of acral melanoma by integrating single-cell and spatial transcriptomic analyses.
实验完整度
高包含scRNA-seq、ST-seq、小鼠足垫移植模型、多重复免疫组化及公共数据集验证，并有Etomoxir功能干预。
主要模型
12例AM患者原发肿瘤组织（scRNA-seq） 5例AM患者原发肿瘤组织（ST-seq） C57BL/6小鼠B16F0-Mitf足垫移植模型 101例AM组织芯片（多重IHC）
重点核对
MYC+MEL和FGFBP2+NKT细胞在LN+AM与LN-AM中的比例差异（scRNA-seq，LN+AM n=6，LN-AM n=6） Etomoxir（40 mg/kg，每日皮下注射）对B16F0-Mitf小鼠淋巴结转移的抑制效果（n=9/组） FGFBP2+NKT细胞在101例AM组织中的多重IHC验证及生存分析 ST-seq中MITF表达与FAO评分的空间一致性（5例患者）
摘要
肢端黑色素瘤（AM）是一种罕见的黑色素瘤亚型，以淋巴结（LN）转移高发为特征，而淋巴结转移是肿瘤播散和治疗决策的关键因素。本研究采用单细胞和空间转录组分析，探究AM早期播散的动态演化。我们的发现揭示了AM中存在显著的肿瘤间和肿瘤内异质性，同时伴有高度免疫抑制的肿瘤微环境和复杂的细胞间通讯网络，尤其在淋巴结转移患者中更为明显。值得注意的是，我们发现MYC+黑色素瘤细胞（MYC+MEL）和FGFBP2+NKT细胞与淋巴结转移密切相关。此外，我们证明淋巴结转移需要MYC+MEL细胞中由MITF诱导的向脂肪酸氧化（FAO）的代谢转变。Etomoxir作为一种临床批准的FAO抑制剂，能够有效抑制MITF介导的淋巴结转移。该综合数据集加深了我们对AM淋巴结转移的理解，并为早期AM播散的治疗靶向提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肢端黑色素瘤早期淋巴结转移的细胞组成、空间特征及分子机制是什么？
- 核心机制
- MYC+MEL细胞中MITF诱导脂肪酸氧化（FAO）代谢转变，促进淋巴结转移；Etomoxir抑制FAO可抑制该过程。
- 主要证据
- scRNA-seq和ST-seq揭示LN+AM中MYC+MEL增加、FGFBP2+NKT减少及FAO通路激活；小鼠足垫移植模型证实Mitf过表达促进淋巴结转移且Etomoxir抑制转移；多重IHC在临床样本中验证FGFBP2+NKT减少与预后不良相关。
- 研究意义
- 为理解AM淋巴结转移机制提供资源，并提示靶向MITF-FAO轴可能用于抑制早期AM播散。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组分析
在空间层面验证细胞类型分布及免疫细胞浸润差异。
对5例AM患者原发肿瘤组织进行ST-seq，使用CARD和RCTD进行反卷积分析。
黑色素瘤细胞亚群鉴定与功能分析
解析黑色素瘤细胞异质性，鉴定与LN转移相关的亚群。
将23,501个黑色素瘤细胞重新聚类为5个亚群，进行SCENIC、伪时间轨迹和RNA velocity分析。
MITF-FAO轴功能验证
验证MITF通过FAO促进淋巴结转移。
构建Mitf过表达B16F0细胞，植入C57BL/6小鼠足垫，并用Etomoxir处理，检测腘淋巴结转移。
免疫细胞亚群分析及临床验证
探究免疫细胞亚群变化与LN转移的关系，并在临床样本中验证。
对13,521个免疫细胞进行亚群分析，使用多重IHC在101例AM组织芯片中验证FGFBP2+NKT细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织消化 | Miltenyi肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒（版本3.1） | 10× Genomics | -- |
| Illumina Nova-Seq 6000 PE150测序系统 | Illumina | -- | |
| 空间转录组测序 | Visium空间转录组平台 | 10× Genomics | -- |
| 免疫组化 | 抗MITF抗体（ab303530） | ABCAM | ab303530 |
| DAB显色试剂盒 | Gene Tech | -- | |
| 多重免疫组化 | 抗CD8抗体（BX50036） | Biolynx | BX50036 |
| 抗CD4抗体（BX50023） | Biolynx | BX50023 | |
| 抗NCAM1抗体（3576S） | CST | 3576S | |
| 抗FGFBP2抗体（HPA039180） | SIGMA | HPA039180 | |
| 抗FAP抗体（BM5121） | Boster | BM5121 | |
| 抗CD31抗体（3528S） | CST | 3528S | |
| 抗Galectin-9抗体（NBP2-45619） | NOVUS | NBP2-45619 | |
| 抗TIM3抗体（45208S） | CST | 45208S | |
| 抗CD45抗体（BX50068） | Biolynx | BX50068 | |
| 抗CD44抗体（3570S） | CST | 3570S | |
| 动物实验 | 乙莫克舍 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P1005 |
| Western blot | 抗MITF抗体（ab303530） | ABCAM | ab303530 |
| 抗Histone-H3抗体（17168-1-AP） | Proteintech | 17168-1-AP | |
| 二抗（P0208） | Beyotime | P0208 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本纳入 | LN+AM与LN-AM分组标准、样本来源（FDZSH/FDSCC/GEO GSE189889）、是否接受过抗肿瘤治疗 阅读提示：Methods-Patient specimens；Supplementary Table 1 |
| 单细胞RNA测序 | 细胞悬液制备流程、测序平台、数据质控标准（UMI/gene阈值、线粒体比例） 阅读提示：Methods-Preparation of single-cell suspensions；Droplet-based single-cell RNA sequencing；scRNA-seq data processing |
| 空间转录组测序 | 组织切片透化时间、测序平台、spot质控参数 阅读提示：Methods-Data analysis of ST-seq |
| 小鼠足垫移植模型 | 细胞接种数量（5×10^5）、Etomoxir剂量（40 mg/kg）、给药途径（皮下注射）、给药起始时间（第二周）、终点（第25天） 阅读提示：Methods-Animal models；Fig. 4f |
| 多重免疫组化 | 抗体面板、稀释比例、抗原修复条件、检测设备 阅读提示：Methods-Multiplex IHC；Supplementary Table 3 |