F17磷酸化形式在线粒体的定位
确定磷酸化F17是否定位到线粒体。
在NHDFs中表达Flag对照、Flag-F17-S53/62E或F17-S53/62A-Flag，感染WT、iF17或iF17R病毒，用MitoTracker Deep Red染色和免疫荧光成像。
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痘病毒F17蛋白拮抗线粒体协调的抗病毒反应
The poxvirus F17 protein counteracts mitochondrially orchestrated antiviral responses.
实验完整度
高包含NHDF和THP1细胞模型、siRNA敲低、抑制剂处理、代谢分析及多种功能验证
主要模型
原代正常人真皮成纤维细胞（NHDFs） THP1单核细胞（野生型及cGAS敲除） BSC-40细胞（用于病毒扩增和滴度测定）
重点核对
NHDFs感染WT、iF17、iF17R病毒（MOI 5），并在6、12、24 h.p.i.检测ISG和cGAS水平 NHDFs用25 μM ddC处理4天或10 μM处理6天（THP1）以耗竭mtDNA NHDFs用MFN1 siRNA转染72小时以敲低MFN1 NHDFs在感染时用50 nM Piericidin、100 nM Antimycin或50 nM Oligomycin处理 NHDFs用10 μM PFK15或200 μM 3-Bromopyruvate在10 h.p.i.处理
摘要
痘病毒是一种不寻常的DNA病毒，在细胞质中复制。为此，它们编码约100种免疫调节蛋白，以对抗胞质核酸传感器如cGAMP合成酶（cGAS）以及其他几种抗病毒反应途径。然而，这些免疫调节剂大多在感染早期表达，而许多是可变宿主范围决定因素，我们对痘病毒感知和逃逸策略的理解仍存在重大空白。在这里，我们表明，感染建立后，病毒生命周期的后续进展通过线粒体的特定变化被感知，这些变化协调抗病毒反应的不同方面。与其他导致广泛线粒体损伤的病毒不同，痘病毒维持关键线粒体功能，包括膜电位和呼吸，同时减少驱动炎症的活性氧。然而，痘病毒复制诱导线粒体过度融合，独立控制线粒体DNA（mtDNA）的释放以激活核酸传感器，并使糖酵解增加，这是支持干扰素刺激基因（ISG）产生所必需的。为了对抗这一点，痘病毒F17蛋白定位到线粒体并失调mTOR，以同时破坏cGAS的稳定性和阻断糖酵解的增加。我们的发现揭示了痘病毒F17蛋白如何解除针对痘病毒复制后期特定线粒体协调反应的武装。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 痘病毒复制后期如何被宿主线粒体感知并触发抗病毒反应，以及F17蛋白如何拮抗这些反应。
- 核心机制
- 痘病毒复制诱导线粒体过度融合，独立控制mtDNA释放以激活cGAS，并增加糖酵解以支持ISG产生；F17蛋白定位线粒体并失调mTOR，同时破坏cGAS稳定性和抑制糖酵解。
- 主要证据
- 在NHDFs和THP1细胞中，iF17病毒感染导致胞质mtDNA增加、cGAS依赖性ISG诱导和糖酵解增强；ddC耗竭mtDNA、MFN1敲低或糖酵解抑制剂均降低ISG反应；F17磷酸化形式定位线粒体。
- 研究意义
- 揭示了痘病毒F17蛋白通过靶向线粒体协调的宿主反应来逃逸免疫感知的机制，增进了对痘病毒感知和逃逸策略的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
痘病毒感染诱导mtDNA释放的检测
验证痘病毒感染是否导致mtDNA释放到胞质。
NHDFs感染WT、iF17或iF17R病毒，通过抗DNA抗体染色和细胞分级分离后PCR/RT-qPCR检测胞质mtDNA。
cGAS依赖性ISG反应的验证
确定ISG反应是否依赖cGAS。
NHDFs感染后6 h.p.i.用cGAS抑制剂G140处理，或使用cGAS敲除THP1细胞，检测ISG表达。
mtDNA耗竭对ISG反应的影响
测试mtDNA是否触发ISG反应。
NHDFs用ddC或EtBr处理耗竭mtDNA，感染iF17病毒，检测ISG表达和mtDNA释放。
线粒体融合对mtDNA释放和ISG反应的调控
验证MFN1介导的线粒体融合是否控制mtDNA释放和ISG反应。
NHDFs转染MFN1 siRNA，感染iF17病毒，检测胞质mtDNA和ISG表达。
糖酵解在ISG反应中的作用
测试糖酵解是否支持ISG产生。
NHDFs感染iF17病毒，测量ECAR和乳酸，或用糖酵解抑制剂PFK15、3-Bromopyruvate处理，或适应半乳糖培养基。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Fisher Scientific | 11875093 | |
| 病毒扩增 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 半乳糖适应 | 无葡萄糖培养基 | ThermoFisher Scientific | A1443001 |
| 透析胎牛血清 | PEAK SERUM | PS-FB1 | |
| D-(+)-半乳糖 | Millipore Sigma | G0750 | |
| EdU标记 | Alexa Fluor-647 Click-iT Plus EdU细胞增殖试剂盒 | ThermoFisher Scientific | C10640 |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | 62249 |
| MitoTracker深红 | ThermoFisher Scientific | M22426 | |
| FluroSave封片剂 | Calbiochem | 345789 | |
| Western blot | Protran硝酸纤维素膜 | Fisher Scientific | 45004006 |
| 兔抗Raptor抗体 | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| 兔抗cGAS抗体 | Cell Signaling Technology | 15102 | |
| 兔抗cGAS抗体 | PROTEINTECH | 26416-1-AP | |
| 兔抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 S | |
| 兔抗磷酸化STING (S366)抗体 | Cell Signaling Technology | 85735 S | |
| 兔抗MxA抗体 | Cell Signaling Technology | 37849 | |
| 兔抗MxB抗体 | PROTEINTECH | 13278-1-AP | |
| 兔抗MxB抗体 | NOVUS BIOLOGICALS | NBP1-81018 | |
| 兔抗ISG56抗体 | Cell Signaling Technology | 14769 | |
| 兔抗ISG54抗体 | PROTEINTECH | 12604-1-AP | |
| 免疫荧光 | 羊抗TGN46抗体 | Bio-Rad | AHP500 |
| Western blot | 小鼠抗Flag M2抗体 | MilliporeSigma | F1804 |
| 兔抗Lamin A/C抗体 | PROTEINTECH | 10298-1-AP | |
| 兔抗FIS1抗体 | PROTEINTECH | 10956-1-AP | |
| 兔抗ATP5a1抗体 | PROTEINTECH | 14676-1-AP | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗DNA抗体 | MilliporeSigma | CBL186 |
| Western blot | 兔抗Pink1抗体 | Abcam | ab216144 |
| 兔抗PARK2/Parkin抗体 | PROTEINTECH | 14060-1-AP | |
| 兔抗Mitofusin-1抗体 | Cell Signaling Technology | 14739 | |
| 兔抗Mitofusin-2抗体 | Cell Signaling Technology | 9482 | |
| 兔抗磷酸化Mitofusin-2 (S442)抗体 | Millipore Sigma | ABC963 | |
| 兔抗VDAC1/2抗体 | PROTEINTECH | 10866-1-AP | |
| 兔抗TFAM抗体 | PROTEINTECH | 22586-1-AP | |
| 兔抗CytB抗体 | PROTEINTECH | 55090-1-AP | |
| 兔抗DRP1抗体 | PROTEINTECH | 12957-1-AP | |
| 兔抗磷酸化DRP1 (S616)抗体 | Cell Signaling Technology | 3455 | |
| 兔抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 兔抗Cleaved Caspase-3 (Asp175)抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 小鼠抗β-Actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 兔抗VacV F17抗体 | ABclonal | -- | |
| 小鼠抗VacV I3抗体 | -- | -- | |
| 小鼠抗VacV E3抗体 | -- | -- | |
| 小鼠抗VacV D8抗体 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗VacV A14抗体 | -- | -- |
| Western blot | 抗小鼠IgG，HRP | Millipore Sigma | NA931V |
| 抗兔IgG，HRP | Millipore Sigma | NA934V | |
| 免疫荧光 | 驴抗小鼠Alexa 488二抗 | ThermoFisher | A21202 |
| 驴抗小鼠Alexa 555二抗 | ThermoFisher | A31570 | |
| 驴抗小鼠Alexa 647二抗 | ThermoFisher | A31571 | |
| 驴抗兔Alexa 488二抗 | ThermoFisher | A21206 | |
| 驴抗兔Alexa 555二抗 | ThermoFisher | A31572 | |
| 驴抗兔Alexa 647二抗 | ThermoFisher | A31573 | |
| 驴抗羊Alexa 488二抗 | ThermoFisher | A11015 | |
| 驴抗羊Alexa 555二抗 | ThermoFisher | A21436 | |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Millipore Sigma | D2438 |
| PP242 | Millipore Sigma | 475988 | |
| 2′,3′-双脱氧胞苷 | Millipore Sigma | D5782 | |
| 扎西他滨（2′-3′-双脱氧胞苷） | Selleckchem | S1719 | |
| 无水乙醇 | Decon Labs, Fisher Scientific | 04-355-450 | |
| 粉蝶霉素 | Cayman Chemical | 15379 | |
| 寡霉素 | Millipore Sigma | 75351 | |
| 环孢素A | Millipore Sigma | C1832 | |
| VBIT4 | Selleckchem | S3544 | |
| PFK15 | Selleckchem | S7289 | |
| 人cGAS抑制剂G140 | Fisher Scientific | NC1924649 | |
| 溴化乙锭 | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| 细胞培养 | 尿苷 | Millipore Sigma | U3750 |
| DNA提取 | IBI基因组DNA迷你试剂盒 | -- | IB47201 |
| PCR | Q5 PCR缓冲液 | NEB | B9027 |
| Q5高保真DNA聚合酶 | NEB | M0491 | |
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | ThermoFisher Scientific | A25741 |
| 凝胶电泳 | SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 |
| RNA干扰 | MFN1 Silencer Select预设计siRNA A | ThermoFisher Scientific | 4392420, ID: s31219 |
| MFN1 Silencer Select预设计siRNA B | ThermoFisher Scientific | 4392420, ID: s31220 | |
| Silencer阴性对照siRNA | ThermoFisher Scientific | AM4635 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | ThermoFisher Scientific | 13778030 | |
| 荧光素酶报告基因检测 | Quanti-Luc | InvivoGen | rep-qlc |
| 活性氧检测 | 活性氧检测试剂盒 | BioVision Inc/Abcam | ab287839 |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | BioVision Inc/Abcam | ab65330 |
| 代谢分析 | Seahorse XF DMEM培养基 | Agilent | 103575-100 |
| Seahorse XF96 PDL细胞培养微孔板 | Agilent | 103730-100 | |
| Seahorse XF 1 M葡萄糖溶液 | Agilent | 103577-100 | |
| Seahorse XF 200 mM谷氨酰胺溶液 | Agilent | 103579-100 | |
| Seahorse XFe96细胞外流量检测试剂盒卡夹 | Agilent | 103729-100 | |
| Seahorse XF校准液 | Agilent | 100840-000 | |
| XF细胞能量表型检测试剂盒 | Agilent | 1033225-100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒感染 | 病毒株（WT、iF17、iF17R、HSV-1）、MOI 5、感染时间（6、12、24 h.p.i.） 阅读提示：Methods中Cell culture and viruses小节及图注 |
| mtDNA释放检测 | 细胞分级分离条件（Digitonin缓冲液、离心速度）、PCR/RT-qPCR引物（mtND4、mtCytB、mtCOI、GAPDH）、循环参数 阅读提示：Methods中Cell lysis and fractionation小节 |
| cGAS抑制剂处理 | G140浓度（如图3所示）、处理时间（6 h.p.i.加入） 阅读提示：图3及其图注 |
| mtDNA耗竭 | ddC浓度（25 μM或10 μM）、处理时间（4天或6天）、EtBr浓度（1 μg/ml）和处理时间（2天） 阅读提示：Methods中Antibodies and reagents小节及图4、补充图7 |
| MFN1敲低 | siRNA浓度（100 pmol/ml）、转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）、转染后时间（72小时） 阅读提示：Methods中RNA interference小节 |
| 糖酵解抑制 | PFK15浓度（10 μM）和3-Bromopyruvate浓度（200 μM）、加入时间（10 h.p.i.） 阅读提示：图8及其图注 |