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        他莫昔芬治疗骨髓增殖性肿瘤：一项II期临床试验及探索性分析

        Tamoxifen for the treatment of myeloproliferative neoplasms: A Phase II clinical trial and exploratory analysis.

        作者信息Zijian Fang, Giuditta Corbizi Fattori, Thomas McKerrell, Rebecca H Boucher, Aimee Jackson, Rachel S Fletcher, Dorian Forte, Jose-Ezequiel Martin, Sonia Fox, James Roberts, Rachel Glover, Erica Harris, Hannah R Bridges, Luigi Grassi, Alba Rodriguez-Meira, Adam J Mead, Steven Knapper, Joanne Ewing, Nauman M Butt, Manish Jain, Sebastian Francis, Fiona J Clark, Jason Coppell, Mary F McMullin, Frances Wadelin, Srinivasan Narayanan, Dragana Milojkovic, Mark W Drummond, Mallika Sekhar, Hesham ElDaly, Judy Hirst, Maike Paramor, E Joanna Baxter, Anna L Godfrey, Claire N Harrison, Simón Méndez-Ferrer
        PMID38001082
        期刊Nat Commun
        发布时间2023-11-25
        DOI10.1038/s41467-023-43175-5
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含II期临床试验（38例患者）及体外细胞系、患者HSPC转录组、小鼠模型等多层级功能与机制验证

        主要模型

        MPN患者外周血CD34+ HSPC JAK2V617F+人细胞系（HEL、SET-2、UKE-1） CALR突变人细胞系MARIMO JAK2V617F或WT JAK2转导的Ba/F3细胞 MPN小鼠模型（Vav-iCre;JAK2V617F骨髓移植）

        重点核对

        患者突变等位基因负荷（JAK2V617F、CALRins5或CALRdel52）在基线及24周的变化，主要终点为≥50%减少 4OH-TAM处理患者来源PBMC的CFU-C数量及突变/野生型集落比例 4OH-TAM处理JAK2V617F+细胞系的细胞活力、eIF2α磷酸化、ATF4翻译及pSTAT5水平 Seahorse分析线粒体呼吸（OCR）及OXPHOS来源ATP，以及复合物I抑制剂4OH-TAM的IC50 小鼠模型中他莫昔芬剂量（14或140 mg/kg，每周3次，2周）对HSPC线粒体呼吸的影响

        摘要

        目前针对骨髓增殖性肿瘤（MPN）的疗法可改善症状，但对肿瘤体积的效果有限。在临床前研究中，他莫昔芬恢复了突变造血干/祖细胞（HSPC）的正常凋亡。TAMARIN II期、多中心、单臂临床试验评估了他莫昔芬在病情稳定、无既往血栓事件且携带JAK2V617F、CALRins5或CALRdel52突变且外周血等位基因负荷≥20%的MPN患者中的安全性和活性（EudraCT 2015-005497-38）。在112周内招募了38名患者，32名完成了24周治疗。研究达到了A'herns成功标准，主要结局（24周时突变等位基因负荷减少≥50%）在3/38名患者中观察到。次要结局包括24周时减少≥25%（5/38）、12周时减少≥50%（0/38）、血栓事件（2/38）、毒性、血液学反应、每个IWG-MRT反应类别和ELN反应标准的患者比例。作为探索性结局，HSPC转录组的基线分析将应答者和非应答者分开，提示一个预测性特征。在应答者的HSPC中，纵向分析显示JAK-STAT信号传导和氧化磷酸化基因的基线高表达，这些基因被他莫昔芬下调。我们进一步在临床前研究中证明，在JAK2V617F+细胞中，4-羟基他莫昔芬抑制线粒体复合物I，激活整合应激反应并减少致病性JAK2信号传导。这些结果值得进一步研究他莫昔芬在MPN中的作用，并仔细考虑血栓风险。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        他莫昔芬在MPN患者中是否安全并能降低突变等位基因负荷，以及其作用机制和应答预测标志是什么。
        核心机制
        他莫昔芬衍生物在线粒体中积累并抑制呼吸链复合物I，减少OXPHOS来源ATP，进而降低致病性JAK2V617F-STAT5信号传导，并调节整合应激反应（ISR）促进突变细胞凋亡。
        主要证据
        II期临床试验中3/38例患者达到主要终点；患者HSPC转录组显示应答者基线JAK-STAT、ISR和OXPHOS基因高表达且被他莫昔芬下调；体外JAK2V617F+细胞系和小鼠模型验证了线粒体复合物I抑制、ATP减少及pSTAT5下调。
        研究意义
        结果支持进一步研究他莫昔芬作为MPN潜在治疗药物，并提示基于HSPC转录组特征前瞻性筛选应答者，但需谨慎考虑血栓风险。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        II期临床试验评估他莫昔芬疗效与安全性

        评估他莫昔芬在MPN患者中降低突变等位基因负荷的安全性和活性。

        38例MPN患者接受他莫昔芬口服治疗（20 mg每日，耐受良好且12周无血液学反应或等位基因负荷降低时递增至40 mg每日），主要终点为24周时突变等位基因负荷减少≥50%。

        2

        患者HSPC对4OH-TAM的体外反应及转录组分析

        探究应答者与非应答者HSPC对4OH-TAM的敏感性差异及基线转录组特征。

        分离患者外周血CD34+ HSPC，用4OH-TAM（10 μM）或溶剂处理24小时，进行CFU-C集落形成实验和基因分型；并对基线及治疗后的HSPC进行RNAseq和GSEA分析。

        3

        JAK2V617F+人细胞系验证他莫昔芬敏感性及ISR激活

        验证他莫昔芬衍生物对JAK2V617F+细胞系的直接杀伤作用及对ISR的调节。

        用4OH-TAM处理HEL、SET-2、UKE-1（有/无马血清）细胞系，检测细胞活力、ATF4翻译、eIF2α磷酸化，并用ISRIB rescue实验验证ISR的作用。

        4

        线粒体呼吸与复合物I抑制的机制验证

        验证他莫昔芬对线粒体呼吸链复合物I的直接抑制作用及其对ATP生成的影响。

        使用Seahorse XF Cell Mito Stress Test和Real-Time ATP Rate Assay检测4OH-TAM处理后的OCR和ATP生成；用透化细胞和纯化牛心线粒体复合物I进行酶动力学分析；用LC-MS/MS检测线粒体内4OH-TAM浓度。

        5

        小鼠模型验证他莫昔芬对HSPC线粒体呼吸的影响

        在体内验证与他莫昔芬临床剂量相当的剂量对HSPC线粒体呼吸的抑制作用。

        在MPN小鼠模型中给予他莫昔芬低剂量（14 mg/kg）或高剂量（140 mg/kg）或溶剂对照，每周3次，共2周，然后分离HSPC富集细胞进行Seahorse呼吸分析。

        6

        他莫昔芬对JAK2-STAT5信号通路的影响验证

        验证他莫昔芬通过抑制线粒体复合物I减少ATP生成，进而降低致病性JAK2V617F-STAT5信号。

        在Ba/F3细胞（表达EpoR并转导WT JAK2或JAK2V617F）和JAK2V617F+人细胞系中，用4OH-TAM处理并联合或不联合MMS或8-Br-ATP，检测pSTAT5和pJAK2水平。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        集落形成单位实验集落形成单位基因分型定量RT-PCRRNA测序
        验证细胞功能变化
        流式细胞术Annexin V/DAPI染色细胞活力检测
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹免疫印迹
        验证机制链路
        Seahorse XF细胞线粒体压力测试Seahorse XF实时ATP速率分析液相色谱-串联质谱共聚焦成像呼吸链复合物I动力学分析
        评估体内效果
        小鼠MPN模型Seahorse XF HS Mini分析仪
        数据分析与统计
        基因集富集分析DESeq2差异表达分析整合通路富集分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养RPMI-1640培养基Thermo Fisher Scientific32404014
        活性炭剥离胎牛血清Thermo Fisher Scientific12676029
        IMDM培养基Thermo Fisher Scientific21056023
        热灭活马血清Thermo Fisher Scientific26050070
        氢化可的松Sigma-AldrichH0888
        DMEM培养基Thermo Fisher Scientific10569010
        胎牛血清Thermo Fisher Scientific26140079
        重组鼠IL-3PeproTech213-13
        动物实验他莫昔芬Sigma-AldrichT5648
        玉米油Sigma-AldrichC8267
        HSPC分离小鼠造血祖（干）细胞富集试剂盒BD Bioscience558451
        RNAseq超纯CD34磁珠试剂盒Miltenyi Biotec130-100-453
        RNA提取TrizolInvitrogen15596026
        RNAseq文库构建Nextera XT DNA文库制备试剂盒IlluminaFC-131-1096
        RNAseq文库质控DNA-1000试剂盒Agilent5067-1504
        集落形成实验StemSpan造血细胞培养基Stemcell Technologies100-0073
        StemSpan CC100细胞因子混合物Stemcell Technologies2690
        4-羟基他莫昔芬Sigma-AldrichH6278
        StemMACS HSC-CFU完全培养基（含Epo）Miltenyi Biotec130-091-280
        流式细胞术重组人血小板生成素Peprotech300-18
        促红细胞生成素PeprotechP8783
        抗pY694-STAT5抗体BD Biosciences562076
        同型对照BD Biosciences557732
        FITC Annexin V抗体BioLegend640906
        DAPIThermo Fisher ScientificD1306
        qRT-PCRQiampDNA迷你试剂盒Qiagen51304
        RNeasy迷你试剂盒Qiagen74104
        高容量cDNA逆转录试剂盒Applied Biosystems4368814
        PowerUp SYBR Green预混液Applied BiosystemsA25742
        报告细胞系构建嘌呤霉素Thermo Fisher ScientificA1113803
        毒胡萝卜素Tocris Bioscience1138
        免疫印迹RIPA裂解液Abcamab156034
        Complete蛋白酶抑制剂混合物片剂Roche Applied Science11697498001
        PhosSTOP磷酸酶抑制剂Roche Applied Science4906845001
        Laemmli上样缓冲液BioRad1610747
        Mini-PROTEAN预制胶BioRad4569034
        ERα抗体Santa Cruzsc-8002
        磷酸化eIF2α XP抗体（Ser51）Cell Signaling Technology3398
        eIF2α抗体Cell Signaling Technology5324
        ATF-4抗体Cell Signaling Technology11815
        磷酸化Stat5抗体Thermo Fisher Scientific71-6900
        Stat5抗体BD Biosciences610191
        JAK2抗体Thermo Fisher ScientificAHO1352
        磷酸化JAK2（Tyr1007/1008）抗体Cell Signaling Technology3771
        磷酸化JAK2（Tyr221）抗体Cell Signaling Technology3774
        抗VDAC1/Porin抗体Santa Cruzsc-390996
        α-Tubulin抗体Sigma-AldrichT5168
        增强化学发光辣根过氧化物酶底物Thermo Fisher Scientific32106
        代谢分析Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒Agilent Technologies103015-100
        Seahorse XFe96/XF Pro细胞培养微孔板Agilent Technologies103794-100
        Cell-Tak细胞粘附剂Corning354240
        XF DMEM培养基Agilent Technologies103335
        Seahorse XFp PDL细胞培养微孔板Agilent Technologies103722-100
        XF实时ATP速率分析试剂盒Agilent Technologies103592-100
        透化实验XF质膜透化剂Agilent Technologies102504-100
        共聚焦成像TOM20抗体Santa Cruzsc-17764
        Image-iT FX信号增强剂Thermo Fisher ScientificI36933
        FLTX1荧光他莫昔芬衍生物MedChemExpressHY-119437
        ProLong Diamond抗淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36961
        复合物I酶活马心细胞色素cSigma-AldrichC7752
        抗霉素Sigma-AldrichA8674
        线粒体分离培养细胞线粒体分离试剂盒Thermo Fisher Scientific89874

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        II期临床试验
        患者入组标准：年龄≥60岁，MPN诊断≥6个月，JAK2V617F/CALRins5/CALRdel52突变且等位基因负荷≥20%，无既往血栓事件；他莫昔芬剂量20 mg每日可递增至40 mg每日；主要终点24周等位基因负荷减少≥50%
        阅读提示：Methods中Human research participants和Protocol treatment小节，以及Table 1
        患者HSPC体外4OH-TAM处理及CFU-C
        4OH-TAM浓度10 μM，处理24小时；CFU-C接种密度5×10^4 cells/ml，培养14天；应答者定义（≥50%或≥25%等位基因负荷减少）
        阅读提示：Methods中Colony-forming unit assay小节，以及Fig. 2图注
        细胞系活力及ISR检测
        4OH-TAM浓度（5、10、15、20 μM），处理时间（24小时或8小时）；UKE-1细胞培养条件（含或不含10%马血清）；ISRIB浓度（文中未明确说明）
        阅读提示：Methods中Flow cytometry和Immunoblotting小节，以及Fig. 3图注
        Seahorse线粒体呼吸分析
        4OH-TAM处理2小时；oligomycin、FCCP、rotenone/antimycin A浓度分别为1 μM、0.5 μM、0.5 μM；细胞接种密度和归一化方法
        阅读提示：Methods中Metabolic studies小节，以及Fig. 4和Fig. 5图注
        小鼠模型他莫昔芬给药
        他莫昔芬剂量14或140 mg/kg，腹腔注射，每周3次，共2周；小鼠品系C57BL/6J，雌性；MPN模型构建方法（Vav-iCre;JAK2V617F骨髓移植）
        阅读提示：Methods中Mouse model小节，以及Fig. 5e,f图注
        pSTAT5流式检测
        4OH-TAM浓度（5、10、15 μM），处理45分钟；THPO 100 ng/ml或EPO 5 U/ml刺激15分钟；固定和透化条件
        阅读提示：Methods中Flow cytometry小节，以及Fig. 7和Fig. 8图注

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