筛选与验证VE-cadherin相互作用E3连接酶
鉴定能与VE-cadherin结合并介导其泛素化的E3连接酶
用AVM BIOMED Snapshot蛋白芯片检测GFP标记hVE-cadherin与21,065种人重组蛋白的结合，筛选出结合最强的E3连接酶CHFR
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泛素连接酶CHFR通过泛素化介导VE-cadherin降解破坏内皮黏附连接
Ubiquitin ligase CHFR mediated degradation of VE-cadherin through ubiquitylation disrupts endothelial adherens junctions.
实验完整度
高包含蛋白芯片筛选、内皮细胞系与siRNA、EC特异性Chfr/FoxO1敲除小鼠、LPS/PA/CLP体内损伤及患者肺组织
主要模型
人肺微血管内皮细胞（HLMVEC） 人真皮微血管内皮细胞系HMEC 内皮细胞特异性Chfr敲除（ChfrΔEC）小鼠 内皮细胞特异性FoxO1敲除（FoxO1ΔEC）小鼠 ARDS患者肺组织标本
重点核对
ChfrΔEC小鼠肺内皮细胞无Chfr表达，且肺组织VE-cadherin较对照增加>3倍 LPS 10 mg/kg腹腔注射后0、6、24 h检测肺VE-cadherin表达与K48/K63多聚泛素化 HLMVEC转染100 nM Sc-siRNA或CHFR-siRNA1后以LPS 5 μg/ml处理 氯沙坦/PA感染模型：GFP-PA01 10^5或10^7 CFU/小鼠气管内滴注 FoxO1抑制剂AS1842856 5 mg/kg腹腔注射每日1次连续4天
摘要
表达于内皮黏附连接（AJs）的血管内皮cadherin（VE-cadherin）对血管完整性和内皮稳态至关重要。本研究发现泛素E3连接酶CHFR是VE-cadherin泛素化依赖性降解的关键机制。CHFR对于通过控制AJs处VE-cadherin蛋白表达破坏内皮至关重要。在内皮细胞（EC）特异性Chfr敲除（ChfrΔEC）小鼠中观察到VE-cadherin表达增加。ChfrΔEC小鼠中LPS诱导的VE-cadherin降解被阻断，提示CHFR在炎症中调控内皮连接屏障的病理生理相关性。ChfrΔEC小鼠中LPS诱导的肺内皮屏障破坏、炎性中性粒细胞外渗和死亡率均被抑制。转录因子FoxO1是CHFR表达的关键上游调控因子。这些发现证明内皮细胞表达的E3连接酶CHFR在调控VE-cadherin表达进而维持内皮连接屏障完整性中的必需作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在血管炎症中，调控内皮黏附连接处VE-cadherin蛋白表达及降解的机制是什么
- 核心机制
- LPS经TLR4-NF-κB-FoxO1轴上调内皮细胞CHFR表达，CHFR作为E3连接酶催化VE-cadherin K48连接多聚泛素化，经蛋白酶体降解VE-cadherin，破坏黏附连接屏障
- 主要证据
- 蛋白芯片筛选显示CHFR与VE-cadherin结合最强；HMEC与HEK293泛素化实验证实CHFR依赖K48多聚泛素化降解VE-cadherin；HLMVEC中CHFR敲低阻止LPS诱导的VE-cadherin泛素化、降解与通透性升高；ChfrΔEC小鼠中LPS诱导的VE-cadherin降解、肺血管渗漏、中性粒细胞浸润和死亡率均被抑制；FoxO1缺失小鼠中CHFR表达及VE-cadherin降解受阻
- 研究意义
- 提示内皮细胞表达的E3连接酶CHFR介导的VE-cadherin降解是内皮屏障破坏及血管炎症发生的重要机制，FoxO1与CHFR在ARDS患者肺内皮细胞中表达升高，可能参与炎性疾病的发病
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析CHFR结构域与VE-cadherin结合及泛素化
确定CHFR各结构域在结合VE-cadherin及介导其泛素化中的作用
构建GFP标记WT-CHFR及ΔFHA、ΔRF、ΔCR、ΔPBZ突变体，转染HMEC行anti-GFP珠拉下实验；在HEK293中共转HA-Ub、CHFR质粒并感染表达mVE-cad-GFP的腺病毒，检测K48/K63多聚泛素化
体外验证CHFR介导VE-cadherin泛素化降解与屏障破坏
验证CHFR在LPS诱导的VE-cadherin降解及内皮通透性升高中的作用
HLMVEC转染CHFR-siRNA后用LPS处理，检测VE-cadherin表达、K48/K63泛素化、免疫染色定位，并用ECIS系统测跨内皮电阻
内皮特异性Chfr敲除小鼠体内验证
在体内验证内皮CHFR对VE-cadherin表达、泛素化及血管炎症的影响
构建ChfrΔEC小鼠，检测肺内皮VE-cadherin及结合蛋白表达、LPS诱导的VE-cadherin降解与K48泛素化、肺血管渗漏、中性粒细胞浸润和死亡率
鉴定FoxO1对CHFR的转录调控
确定CHFR表达的上游转录调控机制
启动子结合位点分析、ChIP验证FoxO1与mChfr启动子结合，并用FoxO1抑制剂AS1842856及内皮特异性FoxO1敲除小鼠验证
患者肺组织验证
评估CHFR与FoxO1在ARDS患者肺内皮细胞中的表达
对非ARDS对照与脓毒症/ARDS死亡患者尸检肺组织切片行vWF、CHFR与FoxO1免疫染色
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子相互作用
验证内皮屏障功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白芯片筛选 | AVM BIOMED Snapshot蛋白质组芯片系统 | AVM BIOMED | -- |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine-2000转染试剂 | -- | -- |
| 泛素化实验 | CalPhos哺乳动物转染试剂盒 | ClonTech | -- |
| 蛋白纯化 | GFP-Trap磁性琼脂糖珠 | ChromoTek | gtma-10 |
| 免疫沉淀 | GFP-Trap琼脂糖 | Chromotek | gta-10 |
| 细胞培养 | 内皮基础培养基MCDB131 | -- | -- |
| EBM-2内皮培养基 | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 MV生长因子 | Lonza | CC-4147 | |
| Matrigel基质胶 | BD Bioscience | 354234 | |
| dispase酶 | BD Bioscience | 354235 | |
| 内皮细胞分离 | 胶原酶A | Roche | 11088785103 |
| 抗小鼠PECAM-1抗体 | EMD Millipore | CBL1337 | |
| Dynabeads M-450（羊抗大鼠IgG） | Invitrogen | 110.35 | |
| 细胞处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | -- |
| 小鼠处理 | AS1842856 FoxO1抑制剂 | -- | -- |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| PAR-1激活肽TFLLRNPNDK-NH2 | Genscript | -- | |
| 血管内皮生长因子 | Sigma | V7259 | |
| 肿瘤坏死因子α | Enzo Life Sciences | ALX-520-002 | |
| 免疫荧光成像 | Alexa 594标记Ly6G抗体 | Biolegend | clone 1A8 |
| Brilliant Violet 421标记LY6G抗体 | Biolegend | clone 1A8 | |
| SeTau647标记CD31抗体 | Biolegend | clone 390 | |
| RNA提取与逆转录 | RNeasy Plus试剂盒 | Qiagen | 74034 |
| 逆转录 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fischer | K1621 |
| RT-qPCR | Fast SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | 4385612 |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-295 |
| 质粒 | pEGFP-C2质粒 | Addgene | 61853 |
| HA标记泛素表达质粒 | Addgene | 17608 | |
| 抗体 | 抗VE-cadherin多克隆抗体（C端） | Abcam | Ab33168 |
| 抗VE-cadherin单克隆抗体（N端） | BioLegend | 348502 | |
| 抗FoxO1单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2880 | |
| 抗CHFR单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | D40H6 | |
| K63连接特异性抗泛素单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 5621S | |
| 抗VE-cadherin单克隆抗体（C端） | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | |
| 抗vWF多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8068 | |
| 抗VE-PTP多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28905 | |
| 抗ICAM-1多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1511 | |
| 抗β-catenin多克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7199 | |
| K48连接特异性抗泛素单克隆抗体 | Millipore Sigma | 05-1307 | |
| 抗β-actin单克隆抗体 | Sigma-Aldrich Inc. | A5441 | |
| 抗GFP多克隆抗体 | Proteintech | 50430-2-AP | |
| 抗CHFR多克隆抗体 | Proteintech | 12169-1-AP | |
| 抗ICAM-1多克隆抗体 | Proteintech | 10831-1-AP | |
| 抗E-selectin/CD62E多克隆抗体 | Proteintech | 20894-1-AP | |
| 抗P-selectin/CD62E多克隆抗体 | Proteintech | 13304-1-AP | |
| 抗Angiopoietin-2多克隆抗体 | Proteintech | 24613-1-AP | |
| 抗MMP3多克隆抗体 | Proteintech | 17873-1-AP | |
| 抗MMP9多克隆抗体 | Proteintech | 10375-2-AP | |
| 抗p120-catenin多克隆抗体 | Proteintech | 12180-1-AP | |
| 抗claudin-5多克隆抗体 | Invitrogen | 34-1600 | |
| Western blot二抗 | 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Sera Care KPL | 5220-0458 |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG | Sera Care KPL | 5450-0011 | |
| 免疫荧光二抗 | Alexa Fluor 594标记鸡抗兔IgG | Invitrogen | A21442 |
| Alexa Fluor 647标记鸡抗小鼠IgG | Invitrogen | A21463 | |
| Alexa Fluor 488标记羊抗兔IgG | Invitrogen | A11034 | |
| Alexa Fluor 546标记驴抗羊IgG | Invitrogen | A11056 | |
| Alexa Fluor 488标记鸡抗兔IgG | Invitrogen | A21441 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白芯片筛选CHFR与VE-cadherin结合 | 芯片蛋白数量21,065、hVE-cad-GFP浓度5 μg/ml、孵育时间90 min及阴性对照设置 阅读提示：Methods中Identification of CHFR binding to CDH5小节及Fig. 1a–c图注 |
| CHFR结构域突变体转染与拉下实验 | 质粒转染量1.5 μg/ml、转染后48 h、MG132 10 μM处理条件及GFP-Trap珠子用量30 μl 阅读提示：Methods中Transfections and anti-GFP antibody bead pull-down assay小节及Fig. 1d–f图注 |
| HEK293泛素化实验 | HA-Ub 0.5 μg/ml、CHFR质粒1.5 μg/ml、腺病毒5 pfu/cell、MG132 10 μM处理4 h及K48/K63抗体检测 阅读提示：Methods中Ubiquitylation assay小节及Fig. 1g、h图注 |
| HLMVEC中CHFR敲低与LPS处理 | CHFR-siRNA1浓度100 nM、转染后72 h、LPS 5 μg/ml处理时间点及独立实验重复数 阅读提示：Methods中Cells小节及Fig. 2a–c图注 |
| 跨内皮电阻测定 | HLMVEC铺于金电极、2% FBS培养基孵育2 h、LPS或PAR-1肽25 μM加入时间点 阅读提示：Methods中Transendothelial electrical resistance measurements小节及Fig. 2e、f图注 |
| ChfrΔEC小鼠体内LPS模型 | 小鼠6-8周龄、LPS 10 mg/kg腹腔注射、0/6/24 h时间点及每组4只 阅读提示：Methods中Mice与Vascular injury model in mice小节及Fig. 3f、Fig. 4图注 |
| PA感染肺损伤模型 | GFP-PA01剂量10^5或10^7 CFU/小鼠、气管内滴注方式及双光子成像时间点6 h 阅读提示：Methods中Vascular injury model in mice与In vivo real-time imaging小节及Fig. 5图注 |
| FoxO1转录调控验证 | AS1842856 5 mg/kg每日1次连续4天、sgRNA质粒30 μg/小鼠静脉注射、给药后4天检测 阅读提示：Methods中Mice小节及Fig. 6g、Fig. 7a–c图注 |
| 患者肺组织免疫染色 | 非ARDS对照与ARDS患者每组5例、尸检石蜡包埋组织及抗体稀释比例 阅读提示：Methods中Human lung specimens与Immunostaining of lung tissue sections小节及Fig. 6h、i图注 |