体内验证PERK抑制剂对ISR的影响
检验GSK'157在体内是否抑制PERK及其下游eIF2α磷酸化。
小鼠腹腔注射递增浓度GSK'157，30 min后腹腔注射Tunicamycin，2.5 h后取肝脏进行免疫印迹。
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其激酶抑制剂激活整合应激反应
Activation of the integrated stress response by inhibitors of its kinases.
实验完整度
高包含小鼠体内实验、HeLa细胞实验、重组蛋白体外激酶实验及热位移结合实验等多个独立证据层级，并有功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6J雄性小鼠 HeLa细胞 重组GCN2蛋白片段 重组eIF2α蛋白
重点核对
GSK'157在体内50 mg/kg、体外0.02–10 μM的浓度依赖性双向效应 GSK'157处理HeLa细胞30 min预处理后与Tm共处理2 h 体外激酶反应使用7.5 nM GCN2、2 μM eIF2α、6或12 μM ATP，30 °C孵育20 min siRNA敲低GCN2/HRI/PERK/PKR 60 h后检测ISR GSK'157与A92的竞争实验浓度范围
摘要
翻译起始因子eIF2α的磷酸化启动整合应激反应（ISR），是一项至关重要的信号事件。激活ISR的蛋白激酶，包括PERK和GCN2，在药物开发中备受关注。本研究发现，广泛使用的ATP竞争性PERK抑制剂GSK2656157、GSK2606414和AMG44在纳摩尔浓度范围内抑制PERK，但令人意外的是，在微摩尔浓度下通过GCN2激活ISR。同样，PKR抑制剂C16也激活GCN2。相反，GCN2抑制剂A92抑制其靶点，但通过PERK诱导ISR。这些发现对于理解ISR生物学及其治疗性调控至关重要，因为大多数临床前研究在微摩尔浓度下使用这些抑制剂。用重组蛋白重建ISR激活表明，PERK和PKR抑制剂直接激活二聚体GCN2，遵循高斯激活-抑制曲线，激活由变构增加GCN2对ATP的亲和力驱动。酪氨酸激酶抑制剂Neratinib和Dovitinib也通过增加GCN2对ATP的亲和力激活GCN2。因此，本文揭示的机制可能与ATP竞争性抑制剂以及可能与其他激酶广泛相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATP竞争性ISR激酶抑制剂在其靶点之外是否会影响其他ISR激酶及ISR整体活性。
- 核心机制
- 亚饱和浓度的ATP竞争性抑制剂结合二聚体GCN2一个原体的ATP结合口袋，变构增加另一原体对ATP的亲和力，从而激活GCN2并诱导ISR；饱和浓度则抑制激酶。
- 主要证据
- 小鼠肝脏、HeLa细胞及重组GCN2/eIF2α体外激酶实验显示GSK'157、GSK'414、AMG44、C16等遵循高斯激活-抑制曲线；热位移实验显示化合物结合GCN2激酶域而非假激酶域；动力学分析显示GSK'157增加GCN2对ATP的亲和力。
- 研究意义
- 为解释既往PERK抑制剂临床前研究中ISR未被抑制的现象提供分子基础，对ISR工具化合物使用及ATP竞争性激酶抑制剂的脱靶激活评估具有广泛意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞水平剂量响应验证ISR激活
确定GSK'157在细胞中对PERK抑制与ISR激活的浓度关系。
HeLa细胞GSK'157预处理30 min后与Tm共处理2 h，检测PERK、eIF2α磷酸化、ATF4及蛋白质合成。
遗传学确定GCN2介导ISR激活
验证GSK'157激活ISR是否依赖GCN2而非PERK或其他ISR激酶。
siRNA分别敲低GCN2、HRI、PERK、PKR，检测GSK'157诱导的eIF2α磷酸化、ATF4及翻译抑制。
体外重组系统重建GCN2激活
用纯化蛋白验证PERK抑制剂是否直接激活GCN2。
重组GCN2片段与eIF2α在ATP存在下孵育，加入递增浓度GSK'157、GSK'414、AMG44或C16，检测GCN2活性和eIF2α磷酸化。
机制验证：结合与ATP亲和力
确定化合物结合GCN2的哪个结构域及是否改变ATP亲和力。
热位移实验检测GCN2激酶域和假激酶域；SEC-MALS检测二聚化；ATP滴定动力学分析测定Kobs和Vmax。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | GSK2656157 | Cayman Chemical Company | 17372 |
| GSK2606414 | Cayman Chemical Company | 17376 | |
| ADP | Cayman Chemical Company | 16778 | |
| Neratinib | Cayman Chemical Company | 18404 | |
| A92 | MedChemExpress | HY-100877 | |
| Dovitinib | APExBIO | A2168 | |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| 咪唑并羟吲哚PKR抑制剂C16 | Sigma-Aldrich | I9785 | |
| AMG44 | Sigma-Aldrich | SML3049 | |
| 体外激酶实验 | eIF2α蛋白 | Sigma-Aldrich | SRP5232 |
| 药物处理 | AMP-PNP | Sigma-Aldrich | A2647 |
| 体外激酶实验 | ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 |
| GCN2激酶片段 | SignalChem Biotech | E12-11G | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher Scientific | D5796 |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | 10270106 | |
| siRNA敲低 | Opti-MEM培养基 | ThermoFisher Scientific | 11058021 |
| 人GCN2 siRNA | Horizon Discovery Biosciences Limited | L-005314-00-0005 | |
| 人HRI siRNA | Horizon Discovery Biosciences Limited | L-005007-00-0005 | |
| 人PERK siRNA | Horizon Discovery Biosciences Limited | L-004883-00-0005 | |
| 人PKR siRNA | Horizon Discovery Biosciences Limited | L-003527-00-0005 | |
| RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher Scientific | 13778-150 | |
| RT-qPCR | RNeasy mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 无RNase DNase套装 | QIAGEN | -- | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 | |
| SYBR Select预混液 | Applied Biosystems | 4472908 | |
| 蛋白质合成检测 | 35S-甲硫氨酸 | Hartmann Analytic | -- |
| Bolt SDS-PAGE 4–12% Bis-Tris凝胶 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 存储磷屏 | GE Healthcare | -- | |
| Typhoon成像扫描仪 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖4B | GE Healthcare | -- |
| 还原型L-谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL柱 | GE Healthcare | -- | |
| Benzonase核酸酶 | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Life Science | 48047900 | |
| Vivaspin20 30 kDa离心过滤器 | -- | -- | |
| Ni-NTA琼脂糖珠 | QIAGEN | 30210 | |
| BL21 Star (DE3)化学感受态细胞 | Invitrogen | C601003 | |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001 | |
| HiTrap Q HP柱 | -- | -- | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75柱 | -- | -- | |
| 离心过滤器 | Sartorius | VS2091 | |
| Western blot | Trans-Blot Turbo转膜系统 | Bio-Rad | -- |
| ATF4抗体 | Proteintech | 10835-1-AP | |
| α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Abcam | ab32157 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling | L57A5 | |
| GCN2抗体 | Cell Signaling | 3302S | |
| 磷酸化GCN2抗体 | Abcam | ab75836 | |
| PERK抗体 | Cell Signaling | D11A8 | |
| PKR抗体 | Santa Cruz | B-10 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling | 4650 S | |
| ECL Prime免疫印迹系统 | Cytiva | RPN2232 | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | BioRad | -- | |
| 免疫印迹 | 抗体剥离缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 2105 |
| 肝脏组织裂解 | RIPA缓冲液 | -- | -- |
| 磷酸酶抑制剂片剂 | Roche Life Science | 04906837001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Life Science | 05693159001 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| SEC-MALS | Dawn Helios ii系统 | Wyatt | -- |
| Optilab rEX示差折光检测器 | Wyatt | -- | |
| 热位移实验 | Prometheus NT.48仪器 | NanoTemper Technologies | -- |
| 免疫印迹 | 山羊抗小鼠Alexa Fluor 680二抗 | Invitrogen | A32729 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 790二抗 | Invitrogen | A27041 | |
| 抗小鼠HRP二抗 | Promega | W402B | |
| 抗兔HRP二抗 | Promega | W401B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内GSK'157与Tunicamycin处理 | 小鼠品系、周龄、GSK'157剂量（50 mg/kg）、Tunicamycin剂量（0.1 mg/kg）、取材时间（第二次注射后2.5 h）、样本量n=3 阅读提示：Methods中Animal experiments小节及Fig. 1a图注 |
| HeLa细胞GSK'157剂量响应 | GSK'157浓度范围（0.02–10 μM）、预处理30 min、Tm共处理2 h、生物学重复数 阅读提示：Fig. 1b图注及Methods中Immunoblots小节 |
| siRNA敲低验证GCN2依赖性 | siRNA预处理60 h、各siRNA货号、GSK'157处理2.5 h 阅读提示：Methods中Cell culture小节及Fig. 2c、d图注 |
| 体外激酶实验 | GCN2浓度7.5 nM、eIF2α浓度2 μM、ATP浓度6或12 μM、孵育温度30 °C与时间20 min、A92竞争浓度40 nM 阅读提示：Methods中In vitro phosphorylation assays小节及Fig. 4、Fig. 5图注 |
| 热位移与SEC-MALS | 蛋白结构域浓度5 μM、化合物浓度100 μM（热位移）或50 μM GSK'157（SEC-MALS） 阅读提示：Methods中Intrinsic thermal shift与SEC-MALS小节 |