鉴定RORγt结合蛋白
寻找与RORγt相互作用的蛋白
用C. rodentium感染小鼠，从结肠固有层分离CD4+ T细胞，用抗RORγt抗体进行免疫共沉淀，沉淀蛋白进行质谱分析，鉴定出Raftlin1；并用GST pull-down验证。
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RORγt-Raftlin1复合体调控Th17细胞致病性及结肠炎症
RORγt-Raftlin1 complex regulates the pathogenicity of Th17 cells and colonic inflammation.
实验完整度
高包含体外细胞实验、基因敲入小鼠模型、多种体内疾病模型及机制验证
主要模型
C57BL/6小鼠及Raftlin1ΔLLNSL基因敲入小鼠 Rag1–/–小鼠 adoptive transfer 结肠炎模型 C. rodentium感染及SFB定植模型 EAE小鼠模型
重点核对
Raftlin1ΔLLNSL小鼠中RORγt-Raftlin1复合体形成被破坏，且Raftlin1ΔLLNSL不与RORγt结合 Raftlin1ΔLLNSL小鼠中C. rodentium诱导的IL-17+IFN-γ+致病性Th17细胞减少，而SFB诱导的IL-17+IL-22+非致病性Th17细胞无变化 Raftlin1ΔLLNSL T细胞 adoptive transfer 后Rag1–/–小鼠结肠炎症状减轻 磷脂（18:1–16:0-PC、16:0–18:1-PC、18:1–18:1-PC）增强WT但非Raftlin1ΔLLNSL Th17细胞的Il-17a表达 Raftlin1通过LLNSL基序与RORγt的AF2结构域结合
摘要
产生白介素IL-17的Th17细胞在许多人类疾病（包括炎症性肠病）中具有致病性，但矛盾的是，在非炎症状态下对于维持肠道屏障完整性至关重要。然而，调控Th17细胞不同转录谱和功能多样性的细胞内机制尚不清楚。在此，我们展示脂筏蛋白Raftlin1在致病性Th17细胞中特异性上调并与RORγt形成复合体。破坏RORγt-Raftlin1复合体导致针对Citrobacter rodentium的致病性Th17细胞减少；然而，对针对共生分节丝状菌的非致病性Th17细胞没有影响。机制上，我们展示Raftlin1将不同的磷脂招募到RORγt并促进Th17细胞的致病性。因此，我们鉴定了一种驱动Th17细胞致病功能的机制，这可能为抑制Th17介导的炎症性疾病的先进治疗策略提供平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 调控Th17细胞不同转录谱和功能多样性（致病性与非致病性）的细胞内机制是什么？
- 核心机制
- Raftlin1通过其LLNSL基序与RORγt的AF2结构域结合形成复合体，将特定磷脂招募至RORγt，从而促进Th17细胞的致病性。
- 主要证据
- 在C. rodentium感染模型中，Raftlin1在致病性Th17细胞中上调并与RORγt结合；Raftlin1ΔLLNSL小鼠中致病性Th17细胞减少且结肠炎减轻；磷脂增强WT但非Raftlin1ΔLLNSL Th17细胞的IL-17表达；FRET证实Raftlin1促进磷脂与RORγt结合。
- 研究意义
- 鉴定了一种驱动Th17细胞致病功能的机制，可能为抑制Th17介导的炎症性疾病提供治疗策略平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Raftlin1与RORγt的相互作用及结合基序
验证Raftlin1与RORγt直接结合并确定结合基序
通过GST pull-down、免疫共沉淀、序列比对、分子对接和突变体（Raftlin1ΔLLNSL）实验验证Raftlin1通过LLNSL基序与RORγt的AF2结构域结合。
验证Raftlin1对RORγt转录活性的影响
探究RORγt-Raftlin1相互作用的功能后果
用IL-17启动子驱动的荧光素酶报告基因实验检测Raftlin1对RORγt转录活性的影响；用shRNA敲低Raftlin1检测IL-17表达；通过核质分离、PLA和ChIP/re-ChIP检测Raftlin1核转位及与IL-17启动子的结合。
分析Raftlin1在UC患者中的表达及与IL-17的相关性
探究Raftlin1在溃疡性结肠炎患者中的临床相关性
分析公共RNA-seq数据集（GSE59071）中RFTN1表达；用实时PCR检测活动期UC患者结肠活检CD4+ T细胞中RFTN1和IL-17A mRNA表达并分析相关性。
构建Raftlin1ΔLLNSL基因敲入小鼠并评估Th17反应
在体内研究RORγt-Raftlin1复合体的功能
用CRISPR-Cas9构建Raftlin1ΔLLNSL小鼠；用C. rodentium感染或SFB定植，通过流式细胞术检测IL-17+、IL-17+IFN-γ+和IL-17+IL-22+细胞；用免疫共沉淀和ChIP验证复合体破坏。
评估Raftlin1ΔLLNSL在结肠炎和EAE模型中的致病性
验证RORγt-Raftlin1复合体在Th17介导的炎症中的作用
将WT或Raftlin1ΔLLNSL小鼠的CD4+CD25–CD45RBhi细胞过继转移至Rag1–/–小鼠，监测结肠炎指标；用MOG35-55肽免疫WT和Raftlin1ΔLLNSL小鼠诱导EAE，评估疾病评分和脊髓基因表达。
鉴定Raftlin1招募的磷脂并验证其功能
探究Raftlin1调节Th17细胞致病性的机制
从C. rodentium感染小鼠的mLN细胞中免疫沉淀RORγt和Raftlin1，用LC-MS分析共沉淀脂质；在体外Th17分化中加入磷脂，检测Il-17a和Il-23r表达；用FRET验证磷脂与RORγt结合；将磷脂处理的Th17细胞过继转移至Rag1–/–小鼠评估致病性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | 抗c-Myc抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-40 |
| 抗Flag抗体 | Sigma Aldrich | F1804 | |
| 免疫沉淀 | 抗RORγt抗体 | eBioscience | 14698882 |
| 抗RORγt抗体 | BD Bioscience | 562197 | |
| 免疫印迹 | 抗GST抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-138 |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-47778 | |
| 抗磷酸化Zap-70/Syk抗体 | CST | 2701 | |
| 抗Zap-70抗体 | CST | 2705 | |
| 抗Lck抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-433 | |
| 抗IκBα抗体 | CST | 9242 | |
| 抗Raftlin抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-514457 | |
| 免疫荧光 | 抗Raftlin-Alexa Fluor 488抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-514457 AF488 |
| 流式细胞术 | 抗CD4-FITC抗体 | Biolegend | 100406 |
| 抗CD4-PE抗体 | BD Bioscience | 553730 | |
| 抗CD8-FITC抗体 | Biolegend | 100706 | |
| 抗CD25-FITC抗体 | Biolegend | 102006 | |
| 抗CD45RB-PE抗体 | BD Bioscience | 553101 | |
| 抗Foxp3-PE抗体 | eBioscience | 12577380 | |
| 抗CD44-FITC抗体 | BD Bioscience | 553133 | |
| 抗CD62L-APC-efluor 780抗体 | eBioscience | 47062182 | |
| 抗IL-17-PerCP-Cy5.5抗体 | Biolegend | 506920 | |
| 抗IL-22-PE抗体 | Biolegend | 516404 | |
| 抗IFN-γ-APC抗体 | BD Bioscience | 554413 | |
| T细胞刺激 | 抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100223 |
| 抗小鼠CD28抗体 | BioXCell | BE0015 | |
| T细胞分化 | 抗小鼠IFN-γ抗体 | BioXCell | BE0054 |
| 抗IL-4抗体 | Biolegend | 504102 | |
| 免疫沉淀检测 | Clean-Blot IP检测试剂（HRP） | Themo Fisher Scientific | 21230 |
| 免疫沉淀 | 抗小鼠IgG（HRP） | abcam | ab131368 |
| 细胞分离 | 固有层解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 初始CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 分子克隆 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | -- |
| Gateway pENTR 3C入门载体 | Invitrogen | -- | |
| Gateway LR Clonase II酶混合物 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4B GST标签蛋白纯化树脂 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 蛋白表达 | Rosetta(DE3)pLysS感受态细胞 | Novagen | -- |
| 实时PCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Verso cDNA合成试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| LightCycler 480 SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| Mastercycler Realplex2实时PCR仪 | Eppendorf | -- | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀实验试剂盒 | Millipore | -- |
| ChIP DNA纯化试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 荧光素酶实验 | Amaxa细胞系核转染试剂盒 | Lonza biosciences | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒 | Promega | -- | |
| Synergy H1多功能微孔板检测仪 | Bio TeK | -- | |
| 免疫印迹 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| ECL western blot检测试剂 | -- | -- | |
| 蛋白鉴定 | Orbitrap质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 脂质组学 | TSQ Altis三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| TriVersa NanoMate自动纳喷雾装置 | Advion Bioscience Ltd. | -- | |
| FRET | 5-FAM标记的RORγt蛋白 | -- | -- |
| Cy5标记的18:1–18:1-PC | Avanti Polar lipids | -- | |
| BioTek SYNERGY H1酶标仪 | BioTek | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSCanto流式细胞仪 | BD | -- |
| FlowJo v10软件 | FlowJo | -- | |
| EAE模型 | 百日咳毒素 | Enzo Life Sciences | -- |
| 结肠镜检查 | 微型内窥镜 | Karl-Storz | -- |
| 免疫荧光 | Duolink PLA荧光实验方案 | Sigma-Aldrich | -- |
| Zeiss LSM880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| SFB定植 | Qiagen粪便DNA纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| 细胞培养 | 转化生长因子β | -- | -- |
| 白介素6 | -- | -- | |
| 白介素23 | -- | -- | |
| 重组白介素12 | -- | -- | |
| 重组白介素4 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | -- | -- |
| 离子霉素 | -- | -- | |
| GolgiStop蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | -- | |
| 脂质组学 | 1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | -- | -- |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | -- | -- | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| C. rodentium感染 | 细菌菌株DBS100（ATCC 51459）、灌胃剂量2×10^9 CFU、小鼠年龄8–10周 阅读提示：Methods中C. rodentium infection and quantification小节 |
| SFB定植 | SFB定植粪便来源、定植时间2–3周、16S rRNA PCR验证 阅读提示：Methods中Segmented Filamentous Bacteria (SFB) colonization and quantification小节 |
| 体外Th17分化 | TGF-β（5 ng/ml）、IL-6（10 ng/ml）、IL-23（50 ng/ml）、anti-IL-4（10 μg/ml）、anti-IFN-γ（10 μg/ml），培养5天 阅读提示：Methods中In vitro T cell differentiation小节 |
| Adoptive transfer结肠炎模型 | CD4+CD25–CD45RBhi细胞分选、过继转移5×10^5细胞/小鼠、监测7周 阅读提示：Methods中Adoptive transfer of colitogenic cells in Rag1−/− mice小节 |
| EAE模型 | MOG35-55肽100 μg、百日咳毒素200 ng两次（第0和1天） 阅读提示：Methods中Experimental encephalitis (EAE) model小节 |
| 磷脂处理 | 磷脂浓度20 μM、三种磷脂（18:1–16:0-PC、16:0–18:1-PC、18:1–18:1-PC） 阅读提示：Methods中In vitro T cell differentiation及图5图注 |
| Raftlin1ΔLLNSL小鼠构建 | gRNA序列、HDR模板、脱靶分析 阅读提示：Methods中Generation of Knock-in mice by CRISPR-Cas9小节及Supplementary Fig. 3 |