建立UC生态系统的空间图谱
在保留组织结构的前提下解析UC微环境的细胞组成和空间分布。
使用40标记物IMC panel对健康供者和UC患者结肠FFPE组织进行成像质谱流式检测，经图像预处理、细胞分割和聚类分析，鉴定17个细胞元聚类。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
选择性氧化保护导致溃疡性结肠炎期间由巨噬细胞协调的组织拓扑变化
Selective oxidative protection leads to tissue topological changes orchestrated by macrophage during ulcerative colitis.
实验完整度
高包含人结肠样本IMC、scRNA-seq、流式验证及小鼠DSS模型体内追踪，并有ROS探针和共培养功能验证
主要模型
19例健康供者与33例UC患者的结肠活检组织 4例健康供者及4例UC患者结肠活检的单细胞RNA测序 C57BL/6J小鼠DSS诱导结肠炎模型 CCR2敲除小鼠DSS结肠炎模型
重点核对
IMC panel包含40个标记物（39个蛋白标记和DNA），所有抗体经IHC和IMC验证 DSS处理浓度1.5%（轻度）或3%（重度，w/v）饮水一周，随后正常饮水四周，指定时间点取材 流式分析使用新鲜结肠样本，正常n=11、UC n=8，独立实验8次 ROS检测使用Cell ROX Green探针，流式或免疫荧光联合CD169染色 Ly6c+ MHC II+炎症巨噬细胞与T/B细胞按1:20比例共培养6小时，Golgi抑制剂阻断4小时
摘要
溃疡性结肠炎是一种具有细胞异质性的慢性炎症性肠病。为了解溃疡性结肠炎生态系统的组成和空间变化，我们在此使用成像质谱流式细胞术和单细胞RNA测序来描绘人类结肠生态系统的单细胞景观。我们发现溃疡性结肠炎区域以巨噬细胞消失反应为特征的组织拓扑变化，仅发生于组织驻留巨噬细胞。溃疡性结肠炎区域活性氧水平较高，但驻留巨噬细胞中几乎检测不到活性氧清除酶SOD2，导致炎症巨噬细胞和驻留巨噬细胞对活性氧的脆弱性不同。炎症巨噬细胞取代驻留巨噬细胞，并通过与T细胞和B细胞形成的细胞因子产生网络，在溃疡性结肠炎期间引起TNF产生的位置转移。我们的研究提示了观察到的驻留巨噬细胞巨噬细胞消失反应的机制组成部分，为其他炎症或感染情况下的巨噬细胞消失反应提供了机制提示。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 溃疡性结肠炎期间组织拓扑结构如何变化，以及驻留巨噬细胞消失反应的机制是什么。
- 核心机制
- UC区域活性氧升高，驻留巨噬细胞因SOD2表达不足而对ROS敏感，发生消失；炎症巨噬细胞高表达SOD2抵抗ROS并取代驻留巨噬细胞，通过与T、B细胞形成IL-1β驱动的细胞因子网络导致TNF-α产生空间转移。
- 主要证据
- IMC和scRNA-seq显示UC区域驻留巨噬细胞减少、炎症巨噬细胞增加；流式验证巨噬细胞替换；ROS探针显示驻留巨噬细胞ROS水平高且SOD2表达低；小鼠DSS模型重现巨噬细胞替换动力学；共培养实验证明炎症巨噬细胞诱导T/B细胞产生TNF-α。
- 研究意义
- 提示了巨噬细胞消失反应的机制，为其他炎症或感染情况下的巨噬细胞消失反应提供机制线索，并可能对未来的ROS和巨噬细胞调节治疗有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证UC中驻留巨噬细胞消失反应
确定UC进展过程中细胞组分变化，特别是巨噬细胞亚群的变化。
比较健康供者和UC患者IMC数据中细胞密度，并用流式细胞术验证新鲜样本中上皮细胞、T细胞、B细胞、驻留和炎症巨噬细胞的变化。
小鼠DSS模型追踪巨噬细胞替换动力学
在体内验证巨噬细胞替换的动力学及CCR2的作用。
建立急性和重度DSS结肠炎模型，在指定时间点用流式分析CD11b+ F4/80hi驻留巨噬细胞和CD11b+ F4/80int炎症巨噬细胞等亚群的比例和绝对数，并比较WT与CCR2敲除小鼠的炎症巨噬细胞浸润。
scRNA-seq确认巨噬细胞消失反应并解析机制
在转录组水平确认UC微环境景观和巨噬细胞消失反应，并探索机制。
对健康供者、UC患者病变和自身对照结肠活检进行scRNA-seq，鉴定主要细胞群和巨噬细胞亚群，进行差异表达、通路富集和SCENIC调控网络分析。
验证ROS/SOD2轴导致驻留巨噬细胞消失
验证ROS水平与SOD2表达不均导致驻留巨噬细胞对ROS敏感。
用ROS探针Cell ROX Green通过流式和免疫荧光检测巨噬细胞亚群ROS水平，联合CD169标记驻留巨噬细胞，分析ROS与驻留巨噬细胞的空间关系。
分析细胞邻域和空间互作变化
确定巨噬细胞切换后局部免疫网络的空间变化。
基于IMC数据定义细胞邻域（CN），使用Voronoi图展示CN分布，进行张量分解鉴定CN-CT模块，并用置换检验分析细胞类型间的空间交互/回避模式。
验证炎症巨噬细胞驱动TNF-α产生空间转移
验证炎症巨噬细胞通过细胞因子网络影响T/B细胞产生TNF-α。
使用NicheNET分析细胞间通讯，并通过小鼠DSS模型分选Ly6c+ MHC II+炎症巨噬细胞与肠系膜淋巴结T/B细胞共培养，流式检测TNF-α产生；mIHC检测TNF-α空间分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DSS诱导结肠炎模型 | 葡聚糖硫酸钠 | Sigma | 42867 |
| 多重免疫组化 | Opal 7色多重免疫组化试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL861001KT |
| DAPI | Akoya Biosciences | -- | |
| ROS检测 | Cell ROX Green活性氧探针 | Thermo Fisher | C10492 |
| 组织包埋 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| 免疫荧光 | CD169抗体 | SCBT | HSn 7D2 |
| 抗小鼠IgG（H+L）F(ab’)2片段（Alexa Fluor 555偶联） | CST | 4409 | |
| 成像质谱流式 | Maxpar X8抗体标记试剂盒 | Fluidigm | -- |
| 铱嵌入剂 | Fluidigm | 201192B | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Gibco | 17104019 |
| DNase I | Merck | 11284932001 | |
| 70微米细胞筛网 | BD | 352340 | |
| Percoll分离液 | Sigma | P4937 | |
| 红细胞裂解液 | BD | 555899 | |
| 流式分析 | Fc受体阻断剂 | BioLegend | 156604 for mouse; 422302 for human |
| BD细胞内染色试剂盒 | BD | 555028 | |
| 共培养 | 高尔基体抑制剂 | BD | 555029 |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞v3试剂盒 | 10X Genomics | -- |
| Chromium控制器 | 10X Genomics | -- | |
| 成像质谱流式 | Hyperion成像质谱流式细胞仪 | Fluidigm | -- |
| 多重免疫组化 | Vectra3 Polaris平台 | PerkinElmer | -- |
| 流式分析 | Fortessa五激光流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| Cy-TOF分析 | Helios质谱流式细胞仪 | Fluidigm | -- |
| 共聚焦成像 | LEICA TCS SP8共聚焦显微镜 | LEICA | -- |
| IMC组织处理 | Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | SRE0098 | |
| SuperBlock封闭液 | Thermo Fisher Scientific | 37515 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IMC样本与panel | 40标记物panel组成、抗体克隆号及金属标签；样本为19例健康供者和33例UC患者FFPE结肠活检，切片厚度4 µm 阅读提示：Methods的IMC acquisition小节及Supplementary Table S1 |
| DSS模型 | DSS浓度1.5%或3%（w/v），饮水一周后正常饮水四周；雄性C57BL/6J小鼠4–6周龄；每天监测体重和粪便隐血 阅读提示：Methods的DSS-induced colitis model小节及Fig. 3a图注 |
| 流式验证 | 新鲜结肠样本消化条件（0.6 mg/mL胶原酶IV、0.01 mg/mL DNase I，37°C 1小时）；正常n=11、UC n=8，独立实验8次；抗体panel见Supplementary Table S1 阅读提示：Methods的FACS and Cy-TOF data acquisition小节及Fig. 2d, f, i图注 |
| scRNA-seq | 4例健康供者、4例UC患者自身对照和病变样本；10× Genomics v3化学；细胞过滤标准（基因数200–6000，线粒体比例<25%）；差异表达阈值adjusted p<0.05且|log2 Fold Change|>1.5 阅读提示：Methods的Single-cell RNA-seq library construction和Single-cell RNA-seq analysis小节 |
| ROS检测 | Cell ROX Green浓度及孵育条件（37°C 1小时）；CD169抗体克隆号HSn 7D2；流式和免疫荧光样本量n=3 阅读提示：Methods的ROS staining小节及Fig. 5f–i图注 |
| 共培养实验 | Ly6c+ MHC II+炎症巨噬细胞与T/B细胞比例1:20；共培养6小时，Golgi抑制剂阻断4小时；TNF-α流式检测 阅读提示：Methods的FACS and Cy-TOF data acquisition小节及Fig. 7f图注 |