鉴定铁代谢相关lncRNA
筛选响应铁变化并可能参与铁代谢调控的lncRNA。
利用LCN2敲低细胞系进行GSEA分析；用FAC或DFO处理MCF-7细胞，通过RT-qPCR检测候选lncRNA表达；敲低6个重叠lncRNA，用Calcein-AM检测细胞铁水平。
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LncRNA通过调控Hippo-YAP信号通路重编程铁代谢
LncRNA modulates Hippo-YAP signaling to reprogram iron metabolism.
实验完整度
高包含细胞系、异种移植小鼠模型、患者组织样本及组学数据，并通过RNA pull-down、RIP、ChIP、荧光素酶报告基因等进行功能与机制验证。
主要模型
MCF-7乳腺癌细胞系 MDA-MB-468乳腺癌细胞系 MDA-MB-468异种移植裸鼠模型 乳腺癌患者组织样本（n=98）
重点核对
LncRIM与NF2的直接结合：RNA pull-down、RIP及重组蛋白结合实验 LncRIM对NF2-LATS1相互作用的抑制：Co-IP及膜组分分离实验 YAP对DMT1的转录调控：ChIP-qPCR及荧光素酶报告基因实验 LncRIM对细胞铁水平的影响：Calcein-AM荧光检测 LncRIM对体内肿瘤生长的影响：裸鼠异种移植瘤体积和重量测定
摘要
铁代谢失调与癌症发展密切相关，但其潜在机制仍知之甚少。越来越多的证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）通过整合信号通路参与多种代谢过程。在本研究中，我们揭示了一个铁触发的lncRNA——LncRIM（LncRNA Related to Iron Metabolism，也称为ZBED5-AS1和Loc729013），它是YAP的靶标，有效连接Hippo通路与铁代谢，并在很大程度上不依赖于IRP2。在机制上，LncRIM直接结合NF2，抑制NF2-LATS1相互作用，导致YAP激活，并通过DMT1和TFR1增加细胞内铁水平。此外，LncRIM-NF2轴依赖Hippo通路介导细胞铁代谢。在临床上，LncRIM高表达与患者生存期较差相关，提示其可能作为生物标志物和治疗靶点。综上所述，我们的研究揭示了一种新机制：LncRIM-NF2轴促进铁介导的反馈环路，从而过度激活YAP并促进乳腺癌发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铁代谢失调与癌症发展相关，但lncRNA是否以及如何连接Hippo信号通路与细胞铁代谢并促进乳腺癌发展尚不清楚。
- 核心机制
- LncRIM直接结合NF2，抑制NF2与LATS1的相互作用，导致YAP激活；激活的YAP转录促进DMT1和TFR1表达，增加细胞内铁水平，进而形成铁触发的LncRIM-NF2反馈环路过度激活YAP。
- 主要证据
- 在MCF-7和MDA-MB-468细胞中通过RNA pull-down、RIP、Co-IP、ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因实验验证LncRIM-NF2-LATS1-YAP-DMT1/TFR1轴；Calcein-AM检测显示LncRIM改变细胞铁水平；裸鼠异种移植瘤实验显示敲低LncRIM抑制肿瘤生长和铁含量；乳腺癌患者样本中LncRIM高表达与YAP、DMT1、TFR1及铁水平正相关，与生存期差相关。
- 研究意义
- 本研究提供了lncRNA与Hippo通路连接细胞铁代谢和肿瘤发生的功能证据，提示LncRIM及其协调分子DMT1/TFR1可能作为乳腺癌的生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证LncRIM对铁代谢和乳腺癌细胞功能的影响
确定LncRIM是否调控细胞铁代谢和乳腺癌进展。
在MCF-7和MDA-MB-468细胞中过表达或敲低LncRIM，用Calcein-AM检测铁水平，用集落形成实验检测细胞增殖，并检测铁代谢相关基因表达。
验证LncRIM与NF2的直接结合及对NF2-LATS1互作的影响
明确LncRIM调控Hippo通路的分子机制。
通过RNA pull-down、RIP、RNA FISH、Co-IP、膜组分分离和免疫荧光实验检测LncRIM与NF2的结合及其对NF2-LATS1相互作用和LATS1膜转位的影响；利用截短突变体定位结合结构域。
验证Hippo-YAP通路在LncRIM调控铁代谢中的作用
确定LncRIM调控铁代谢是否依赖YAP。
在YAP敲低或回补的MCF-7细胞中过表达LncRIM，检测DMT1、TFR1表达和细胞铁水平；通过ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因实验验证YAP/TEAD对DMT1启动子的直接调控。
验证铁触发的LncRIM-NF2反馈环路
探究铁刺激是否通过LncRIM-NF2轴反馈激活YAP。
用FAC或DFO处理MCF-7和MDA-MB-468细胞，检测YAP和LATS1磷酸化及LncRIM表达；通过RIP和Co-IP检测铁刺激下LncRIM与NF2结合及NF2-LATS1互作变化；用荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证YAP/TEAD对LncRIM启动子的调控。
体内验证LncRIM-YAP轴对肿瘤生长和铁代谢的影响
在体内验证LncRIM通过铁代谢促进肿瘤进展。
将对照或LncRIM敲低的MDA-MB-468细胞皮下注射到裸鼠，测量肿瘤体积和重量，检测Ki67、CD31、YAP、DMT1、TFR1表达及铁含量；进一步在LncRIM过表达背景下双敲低DMT1/TFR1，观察肿瘤生长和铁含量变化。
临床样本分析LncRIM表达与预后的关系
评估LncRIM在乳腺癌临床样本中的表达及其与临床指标的相关性。
通过RT-qPCR检测乳腺癌组织和配对癌旁组织中LncRIM表达，通过IHC检测YAP、Ki67、CD31、DMT1、TFR1表达及铁染色，分析LncRIM表达与患者生存期的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良必需培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 铁水平检测 | 钙黄绿素乙酰氧基甲酯 | YEASEN | 40719ES50 |
| 铁处理 | 柠檬酸铁铵 | -- | -- |
| 铁螯合处理 | 去铁胺 | -- | -- |
| Western blot | 抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | #14074S |
| 抗磷酸化YAP (Ser127)抗体 | Cell Signaling Technology | #13008S | |
| 抗磷酸化LATS1 (Thr1079)抗体 | Cell Signaling Technology | #8654S | |
| 抗磷酸化LATS1 (Ser909)抗体 | Cell Signaling Technology | #9157S | |
| 抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | #3477S | |
| 抗NF2抗体 | Cell Signaling Technology | #12888S | |
| 抗TFR1抗体 | Proteintech | 10084-2-AP | |
| 抗DMT1抗体 | Proteintech | 20507-1-AP | |
| 抗IRP2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-33682 | |
| 抗FTH1抗体 | ABclonal | A19544 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abmart | M20050 | |
| ChIP | 抗TEAD4抗体 | abcam | ab197589 |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 647) | abcam | ab150083 | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Cell Signaling Technology | #9449 |
| 抗CD31抗体 | ABclonal | A0378 | |
| 流式细胞术 | 抗CD11c-PE | eBioscience | #12-0114 |
| 抗CD206-APC | eBioscience | #17-2061 | |
| 抗F4/80-FITC | Biolegend | #123116 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Pierce | 88803 |
| FLAG-M2磁珠 | Sigma | M8823 | |
| S蛋白琼脂糖珠 | Millipore | 69704 | |
| HA磁珠 | Pierce | 88837 | |
| RNA pull-down | M-280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | -- |
| TranscriptAid SP6/T7高产率转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AMB13345 | |
| 生物素RNA标记混合物 | Roche | -- | |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| iTaqTM通用SYBR Green Supermix qPCR试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞活力检测 | MTS试剂 | Promega | G1111 |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | YEASEN | 40301ES50 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E1910 |
| ChIP | ChIP-qPCR检测试剂盒 | Merck Millipore | #17-371 |
| 铁染色 | Perl普鲁士蓝染色 | Leica | 38016SS7 |
| 增强型DAB铁染色试剂盒 | Solarbio | #G1428 | |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Sigma | C4-28-100MG |
| DNase I | Invitrogen | EN0521 | |
| 克隆 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | -- |
| T4连接酶 | Promega | -- | |
| pGL4荧光素酶报告载体 | Promega | -- | |
| pGEM-T easy载体 | Promega | -- | |
| 蛋白纯化 | GST磁珠 | Sangon Biotech | -- |
| His标签磁珠 | BBl | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞铁水平检测 | Calcein-AM浓度0.15 µM，孵育30分钟，37°C；检测波长λex 488 nm，λem 518 nm 阅读提示：参见Methods中“Real-time intracellular iron”小节 |
| 铁刺激处理 | FAC浓度（100 µM、200 µM等）、DFO浓度（100 µM）、处理时间（24小时等） 阅读提示：参见Figure 1f, 4a, 4b, 4c, 4d及对应图注 |
| LncRIM敲低/过表达 | shRNA序列及敲低效率验证、过表达载体构建 阅读提示：参见Methods中“Short interfering RNA, short hairpin RNA, and RNA interference”及Supplementary Table 5 |
| RNA pull-down | 生物素标记RNA用量（3-7 µg）、细胞裂解液用量（0.5-1 mg）、孵育时间（2-4小时，4°C） 阅读提示：参见Methods中“RNA pull-down assay and dot blot assay” |
| 异种移植瘤实验 | 细胞接种数量（3×10^6）、小鼠品系（BALB/c nude）、周龄（4-5周）、每组小鼠数（n=5）、肿瘤体积测量频率（每两天一次） 阅读提示：参见Methods中“Xenograft mouse model”及Figure 5图注 |