叶脉微通道基底制备与LVD组织自组装
建立叶脉导向的细胞-水凝胶自组装体系，形成高度排列的管状组织。
利用软光刻制作PDMS叶脉微通道基底，经pluronic F-127处理防止细胞粘附；将HUVECs/rat CMs/hiPSC-CMs与fibrinogen/thrombin混合注入微通道，37°C凝胶后培养，细胞牵引力导致水凝胶压实和重塑。
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叶脉导向的细胞排列用于具有组织样功能的宏观心脏构建体
Leaf-venation-directed cellular alignment for macroscale cardiac constructs with tissue-like functionalities.
实验完整度
高包含HUVEC体外模型、新生大鼠CMs和hiPSC-CMs体外模型、离体猪心验证，并进行了功能与机制验证。
主要模型
HUVECs（人脐静脉内皮细胞） 新生大鼠心肌细胞 hiPSC-CMs（人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞） 离体猪心
重点核对
细胞密度固定为2×10^7 cells/ml， fibrinogen终浓度3 mg/ml 新生大鼠CMs来自2日龄Sprague-Dawley大鼠，约30只用于细胞分离 hiPSC-CMs培养17天，评价结构成熟和基因表达 电生理记录使用直径30 μm铂丝微电极，异丙肾上腺素5 μM处理 3D构建体由4层LVD-rat-cardiac和LVD-HUVEC组织组装，厚度约500 μm
摘要
重现天然心肌复杂的结构、力学和电生理特性对于工程化功能性心脏组织至关重要。在此，我们报道了一种叶脉导向策略，该策略能够使细胞-水凝胶杂合体在预定图案中压实和重塑为高度排列且密集堆积的组织。该策略有助于形成相互连接的管状结构，细胞沿分级通道排列。与随机分布的细胞相比，来自新生大鼠心肌细胞的工程化叶脉导向心脏组织表现出先进的成熟度和功能性，表现为可检测的电生理活动、宏观同步收缩和成熟基因上调。作为演示，人诱导多能干细胞衍生的叶脉导向心脏组织随时间推移被工程化出明显的结构和功能改善。借助弹性支架，叶脉导向组织被组装成具有编程力学性能的3D厘米级心脏构建体，这些构建体可通过管道递送而不影响细胞活力。本策略可能生成具有多方面功能的心脏构建体以满足临床需求。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过叶脉导向策略工程化具有高度排列和密集堆积结构、并具备组织样功能的大尺度心脏构建体？
- 核心机制
- 叶脉-inspired微通道引导细胞-水凝胶自组装，通过细胞牵引力使水凝胶压实和重塑，形成沿通道高度排列的管状结构，从而促进心肌细胞成熟和同步电生理功能。
- 主要证据
- HUVEC和fibrin水凝胶在微通道中自组装为排列的管状结构；新生大鼠CMs和hiPSC-CMs在LVD组织中显示 sarcomeric α-actinin和CX43表达增加、钙瞬变同步、可检测场电位；3D构建体具有各向异性力学性能并可注射递送。
- 研究意义
- 该策略可能生成具有多方面功能的心脏构建体以满足临床需求，并可用于药物筛选和原位电生理监测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LVD-HUVEC组织形成过程与结构表征
验证LVD策略能否引导内皮细胞形成相互连接的管状结构，并表征其动态形成过程。
使用HUVECs与荧光fibrin水凝胶在微通道中培养，于不同时间点用激光扫描共聚焦显微镜观察；免疫荧光染色CD31和F-actin；SEM和TEM观察超微结构；AFM测量局部杨氏模量。
LVD-新生大鼠心脏组织构建与成熟度评价
验证LVD策略能否工程化高度排列的心脏组织并促进心肌细胞成熟。
新生大鼠CMs与fibrin水凝胶混合注入叶脉微通道，培养5天；免疫荧光染色sarcomeric α-actinin和CX43；qRT-PCR检测成熟相关基因；AFM测量组织刚度。
LVD-心脏组织电生理功能评价
验证LVD心脏组织是否具有同步收缩和电生理功能，并测试药物反应和电刺激起搏。
使用Fluo-8 AM检测钙瞬变；内置铂微电极记录细胞外场电位；加入异丙肾上腺素观察频率变化；施加电刺激测试起搏。
hiPSC-CMs来源的LVD人心脏组织工程化
验证LVD策略能否工程化人源心脏组织并随时间成熟。
hiPSC-CMs与fibrin水凝胶混合注入微通道，培养17天；记录跳动频率和收缩运动；免疫荧光染色sarcomeric α-actinin、CX43和cTnT；qRT-PCR检测成熟基因。
3D预血管化心脏构建体的组装与力学表征
验证能否将LVD组织组装成具有编程力学性能的3D厘米级构建体。
使用EHD打印的PCL弹性支架转移LVD组织，fibrin水凝胶作为胶水粘合多层组织；FEA模拟和单轴拉伸测试力学性能。
3D LVD心脏构建体的可注射递送验证
验证3D构建体能否通过管道递送并保持细胞活力和结构完整性。
将4层构建体卷曲在直径2.5 mm的棒上，转移入内径6 mm管道，用水流冲出并恢复形状；离体猪心贴附；live/dead染色评估细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 牛血浆纤维蛋白原 | Sigma-Aldrich | 341573 |
| 牛血浆凝血酶 | Solarbio | T2081 | |
| 荧光标记 | 人血浆纤维蛋白原Alexa Fluor 488偶联物 | Thermo Fisher Scientific | F13191 |
| 细胞培养 | 内皮生长培养基EGM-1 | ScienCell | 1001 |
| 细胞分离 | II型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17101015 |
| 细胞培养 | 5-溴-2'-脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | B5002 |
| 细胞活力检测 | Live/Dead细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | L3224 |
| 细胞追踪 | 红色和绿色细胞追踪染色试剂盒 | Invitrogen | C7025, C34552 |
| 细胞骨架染色 | Alexa Fluor 594鬼笔环肽 | Invitrogen | A12381 |
| 细胞核染色 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd | -- |
| 钙瞬变检测 | Fluo-8 AM钙指示剂试剂盒 | AAT Bioquest | 21082 |
| 免疫荧光 | 小鼠抗肌节α-辅肌动蛋白抗体 | Abcam | ab9465 |
| 兔抗CX43抗体 | Abcam | ab11370 | |
| 兔抗CD31抗体 | Abcam | ab182981 | |
| 兔抗心肌肌钙蛋白T抗体 | Proteintech | 15513-1-AP | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG | Invitrogen | A11012 | |
| 山羊抗兔IgG (Alexa Flour-488) | Abcam | 150081 | |
| RNA提取 | RNAfast200 RNA提取试剂盒 | Fastagen | 220010 |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | TAKARA | RR047A |
| TB Green Premix Ex Taq II | TAKARA | RR820L | |
| 细胞培养 | 人诱导多能干细胞衍生心肌细胞 | Help Therapeutics | HELP4111, NovoCellTM |
| 电生理记录 | 控制器板 | Intan Technologies | RHS2000 |
| 放大器芯片 | Intan Technologies | RHS2116 | |
| Omnetics连接器 | Omnetics connector corporation | A79024 | |
| POGO PIN弹簧探针电极 | SZXHN | -- | |
| EHD打印 | 医用级聚己内酯 | Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd | -- |
| AFM | AFM探针 | Bruker | NP-O10 |
| 玻璃珠 | Sigma | -- | |
| 细胞培养 | 包被液 | Help Therapeutics | F00201 |
| 细胞复苏培养基 | Help Therapeutics | F00901 | |
| 心脏维持培养基 | Help Therapeutics | F00301 | |
| 细胞消化 | 专用胰蛋白酶 | Help Therapeutics | F00101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LVD组织自组装 | 细胞密度2×10^7 cells/ml；fibrinogen终浓度3 mg/ml；thrombin 6 U/ml；37°C凝胶15 min 阅读提示：Methods中Formation and culture of LVD tissues小节 |
| 新生大鼠CM分离与培养 | 2日龄Sprague-Dawley大鼠，约30只；胶原酶II 1.5 mg/mL消化7-8次，每次5 min；5-BrdU 0.1 mM；差速贴壁1.5 h 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| hiPSC-CMs培养与LVD组织构建 | hiPSC-CMs培养17天；细胞密度2×10^7 cells/ml；每2天换液 阅读提示：Methods中Cell culture和Formation and culture of LVD tissues小节 |
| 电生理记录与药物处理 | 铂微电极直径30 μm；异丙肾上腺素5 μM；电刺激10 V，50 ms，1 Hz和2 Hz 阅读提示：Methods中Electrophysiologic assessment和Drug treatment小节，Fig. 4 |
| 3D构建体组装与力学测试 | PCL支架EHD打印参数：电压2.7 kV，距离2 mm，流速45 μL/h，速度5 mm/s，温度80°C；fibrinogen 3 mg/ml，37°C聚合5 min；4层构建体厚度约500 μm 阅读提示：Methods中EHD printing of elastic PCL scaffold和Mechanical analysis小节，Fig. 6 |