构建自我捕获型TOP3A突变体
生成可稳定捕获TOP3A-DNA切割复合物的工具。
通过定点突变将人类TOP3A第364位精氨酸突变为色氨酸（R364W），构建FLAG标签TOP3A-R364W表达质粒。
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人类拓扑异构酶IIIα切割复合物的复制相关形成与修复
Replication-associated formation and repair of human topoisomerase IIIα cleavage complexes.
实验完整度
高使用TOP3A-R364W突变体，结合RADAR、iPOND、DNA combing、免疫荧光及多种基因敲除/敲低细胞模型，完成功能与机制验证
主要模型
U2OS细胞系 HEK293细胞系 HCT116细胞系（含TDP2 KO） TK6细胞系（SPRTN KO）
重点核对
TOP3A-R364W质粒转染48 h，RADAR assay检测TOP3Accs 双胸苷同步化后分别在G1、S、G2/M期收获细胞检测TOP3Accs APH（1 µM，1 h）或CD437预处理后检测TOP3Accs siRNA敲低SPRTN、TDP2、MRE11、CtIP、ATM或RAD51后检测TOP3Accs DNA combing中CldU和IdU各标记30 min，统计复制叉速度和不对称叉
摘要
拓扑异构酶IIIα（TOP3A）属于保守的IA型DNA拓扑异构酶家族。本文报道，人类TOP3A与DNA复制叉相关，并且一个“自我捕获”型TOP3A突变体（TOP3A-R364W）会产生细胞内的TOP3A DNA切割复合物（TOP3Accs）。我们证明，被捕获的TOP3Accs会干扰复制，诱导DNA损伤和基因组不稳定。为了阐明TOP3Accs如何被修复，我们探究了Spartan（SPRTN）的作用，这是一种与DNA复制相关的金属蛋白酶，可消化形成DNA-蛋白质交联（DPCs）的蛋白质。我们发现，SPRTN缺陷细胞显示TOP3Accs升高，而SPRTN过表达则降低细胞内TOP3Accs。SPRTN被去泛素化，并且在响应TOP3Accs时与TDP2上位。此外，我们发现MRE11可以切除TOP3Accs，并且细胞周期决定了对SPRTN-TDP2通路与ATM-MRE11通路的偏好，分别在S期与G2期。我们的研究强调了TOP3Accs修复机制的普遍性，以确保正常的DNA复制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类TOP3A是否与DNA复制叉相关，以及TOP3A切割复合物（TOP3Accs）如何形成和被修复。
- 核心机制
- TOP3A在S期与活跃复制叉结合，自我捕获型R364W突变体稳定TOP3Accs；TOP3Accs主要通过SPRTN-TDP2（S期）和ATM-CtIP-MRE11（G2/M期）两条平行通路修复。
- 主要证据
- RADAR assay显示TOP3Accs主要在S期积累并可被APH降低；iPOND和免疫荧光显示TOP3A与复制叉蛋白CDC45、RPA1、RPA2共定位；SPRTN或TDP2缺失升高TOP3Accs，MRE11缺失升高G2/M期TOP3Accs；DNA combing显示R364W突变体降低复制叉速度并增加不对称叉。
- 研究意义
- 揭示了TOP3Accs修复机制在维持正常DNA复制和基因组完整性中的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测TOP3Accs形成
验证R364W突变体是否在细胞内产生TOP3A DNA切割复合物。
将TOP3A-WT或TOP3A-R364W转染HEK293和HCT116细胞48 h，用RADAR assay分离DNA-蛋白质共价复合物，以抗TOP3A抗体检测。
分析TOP3Accs的细胞周期分布
确定TOP3Accs是否受细胞周期调控。
用双胸苷阻断同步化U2OS细胞，释放后在G1、S和G2/M期收获细胞，进行RADAR assay检测TOP3Accs。
验证TOP3A与复制叉的物理关联
检测TOP3A是否存在于新生DNA上并随复制叉移动。
进行iPOND实验，用EdU脉冲标记15 min后点击反应分离新生DNA上的蛋白质，免疫印迹检测TOP3A；并用免疫荧光观察TOP3A与CDC45、RPA1、RPA2共定位。
评估TOP3Accs对复制叉进程的影响
确定被捕获的TOP3Accs是否影响DNA复制。
在表达TOP3A-WT或TOP3A-R364W的U2OS细胞中进行DNA combing实验，依次用CldU和IdU各标记30 min，统计复制叉速度和对称性。
检测TOP3Accs对细胞存活和基因组稳定性的影响
评估TOP3Accs的细胞学后果。
进行 colony formation assay、γH2AX和RAD51免疫荧光、Western blot检测pATM/pCHK1/pATR/pCHK2，以及有丝分裂染色体桥分析。
鉴定TOP3Accs的修复通路
确定SPRTN、TDP2、MRE11、CtIP和ATM在TOP3Accs修复中的作用及相互关系。
在HCT116（含TDP2 KO）和TK6（SPRTN KO）细胞中，用siRNA敲低SPRTN、MRE11、CtIP、ATM或TDP2，转染TOP3A-R364W后RADAR assay检测TOP3Accs；并用SPRTN-WT、E112A、ΔUBZ回补实验验证结构域功能。
确定修复通路的细胞周期偏好
分析SPRTN-TDP2与MRE11通路在不同细胞周期时相的作用。
在同步化U2OS细胞中分别敲低SPRTN、MRE11或TDP2，转染TOP3A-R364W后分选S期和G2/M期细胞，RADAR assay检测TOP3Accs。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | QuikChange II XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 细胞培养与转染 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 084564 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 青霉素 | ThermoFischer | -- | |
| 链霉素 | ThermoFischer | -- | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFischer | L3000015 |
| RADAR assay | DNAzol试剂 | ThermoFisher Scientific | 10503027 |
| 抗TOP3A抗体 | Proteintech | 14525-1-AP | |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗PCNA抗体 | Cell Signaling Technology | 13110 | |
| 抗CDC45抗体 | Cell Signaling Technology | 11881 | |
| 抗H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| 抗EGFP抗体 | Clontech | 632380 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3936 | |
| 抗SPRTN抗体 | Atlas Antibodies | HPA025073 | |
| 抗MRE11抗体 | GeneTex | GTX70212 | |
| 抗CtIP抗体 | Cell Signaling Technology | 9201 | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5411 | |
| 抗TOMM20抗体 | Sigma | HPA011562 | |
| 抗SUMO-1抗体 | Cell Signaling Technology | 4940 | |
| 抗SUMO-2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 4971 | |
| 抗TRIM41抗体 | Abcam | ab111580 | |
| 抗BLM抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365753 | |
| 抗RMI1抗体 | Thermo Fischer Scientific | 14630-1-AP | |
| 抗磷酸化ATR(T1989)抗体 | Abcam | ab223258 | |
| 抗磷酸化Chk1(S345)抗体 | Cell Signaling Technology | 2348 | |
| 抗磷酸化ATM(S1981)抗体 | Cell Signaling Technology | 13050 | |
| 抗磷酸化Chk2(Thr68)抗体 | Cell Signaling Technology | 2661 | |
| 抗TOP1抗体 | BD Biosciences | 556597 | |
| 抗TOP2A抗体 | Millipore | MAB4197 | |
| 抗TOP2B抗体 | BD Biosciences | 611493 | |
| 抗小鼠IgG ECL辣根过氧化物酶偶联二抗 | GE Healthcare | NA9310 | |
| 抗兔IgG ECL辣根过氧化物酶偶联二抗 | GE Healthcare | NA9340 | |
| 免疫荧光 | 抗RPA1抗体 | Cell Signaling Technology | 2267 |
| 抗RPA2抗体 | Cell Signaling Technology | E8X5P | |
| 抗RAD51抗体 | Sigma-Aldrich | PC130 | |
| 抗γH2AX(S139)抗体 | Millipore | 05-636 | |
| 抗小鼠Alexa Fluor 488二抗 | Thermo Fischer Scientific | A28175 | |
| 抗兔Alexa Fluor 568二抗 | Thermo Fischer Scientific | A-11011 | |
| 含DAPI的VECTASHIELD封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| DNA combing | 氯脱氧尿苷 | Sigma | -- |
| 碘脱氧尿苷 | Sigma | -- | |
| 抗BrdU抗体（识别CldU） | BD Biosciences | 347580 | |
| 抗BrdU抗体（识别IdU） | Abcam | Ab6326 | |
| 抗单链DNA抗体 | Millipore | MAB3034 | |
| 抗小鼠Cy3二抗 | Abcam | AB97035 | |
| 抗大鼠Cy5二抗 | Abcam | AB6565 | |
| 山羊抗小鼠BV480二抗 | Jackson ImmunoResearch | 115-685-166 | |
| 免疫沉淀 | 抗EGFP抗体 | Clonetech | JL-8 |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞周期分析 | Click-iT EdU Alexa Fluor 488流式细胞术检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DAPI染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DUST assay | 苯佐酶核酸酶 | EMD Millipore | -- |
| 天然BrdU实验 | 溴脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗BrdU抗体 | BD Biosciences | 347580 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TOP3Accs形成检测 | 质粒转染48 h，RADAR assay中抗TOP3A抗体稀释1:1000，细胞系为HEK293和HCT116 阅读提示：Methods中RADAR assay小节及Fig. 1c图注 |
| 细胞周期同步化 | 双胸苷阻断同步化U2OS细胞，释放后在G1、S和G2/M期收获 阅读提示：Fig. 2a图注及Results中对应段落 |
| 复制叉速度检测 | CldU和IdU各100 µM标记30 min，DNA combing实验条件 阅读提示：Methods中DNA combing小节及Fig. 3a图注 |
| SPRTN功能验证 | siRNA转染后72 h检测，SPRTN-WT、E112A、ΔUBZ回补质粒共转染 阅读提示：Fig. 5b–d图注及Methods中siRNA transfections小节 |
| ATM抑制剂处理 | KU-55933 20 µM处理2 h 阅读提示：Fig. 6f–g图注 |
| 有丝分裂染色体分析 | nocodazole处理3 h后释放45 min，PICH抗体标记超细桥 阅读提示：Fig. 4h图注及Methods中Mitotic analysis小节 |