多组学样本采集与单核测序
在单核水平解析ccRCC转录组和染色质可及性图谱
对CPTAC ccRCC冰冻粉碎组织进行snRNA-seq（34例）和snATAC-seq（28例），FACS分选DRAQ5或7AAD标记的细胞核，10x Genomics建库，Illumina NovaSeq 6000测序；整合bulk WES、RNA-seq和蛋白质组数据。
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表观遗传和转录组特征分析揭示透明细胞肾细胞癌的进展标志物和关键通路
Epigenetic and transcriptomic characterization reveals progression markers and essential pathways in clear cell renal cell carcinoma.
实验完整度
高含snRNA-seq/snATAC-seq、bulk蛋白基因组学、空间转录组、细胞系敲低、免疫荧光及PDX模型等多层证据。
主要模型
34例ccRCC患者snRNA-seq样本（含4例癌旁正常组织） 28例ccRCC患者snATAC-seq样本（含4例癌旁正常组织） Caki-1、RCC4、SKRC-42 ccRCC细胞系 PDX肿瘤模型NSG小鼠
重点核对
snRNA-seq共34例样本（25例患者），snATAC-seq共28例样本（24例患者），均含4例NAT CP敲低使用Caki-1细胞，两个shRNA构建体（sh-CP-C1、sh-CP-C2）与非转导对照（sh-NT1、sh-NT2）比较，bulk RNA-seq鉴定DEGs（FDR<0.05，|log2FC|>1） KLF9敲低使用RCC4细胞（sh-KLF9 vs sh-NC），Western blot检测KLF9和CP蛋白，4次独立实验 空间转录组使用2例ccRCC FFPE样本，Visium平台（10x Genomics），比较CP高/低表达区域 BAP1/PBRM1突变分析分组：4例BAP1突变、9例PBRM1突变、2例双突变、8例无突变，snATAC-seq比较DACRs（FDR<0.05）
摘要
识别肿瘤细胞特异性标志物并阐明其表观遗传调控和空间异质性，可为癌症病因学提供机制性见解。本研究对34例和28例人透明细胞肾细胞癌（ccRCC）标本分别进行snRNA-seq和snATAC-seq，并匹配 bulk 蛋白质基因组学数据。通过多组学分层方法识别20个肿瘤特异性标志物，揭示铜蓝蛋白（CP）高表达与生存期缩短相关。CP敲低结合空间转录组学提示CP在调控ccRCC透明变性间质和肿瘤-间质相互作用中发挥作用。瘤内异质性分析将肿瘤细胞内在炎症和上皮-间质转化（EMT）描绘为肿瘤亚群的两个显著特征。最后，BAP1突变与染色质可及性广泛降低相关，而PBRM1突变通常增加可及性，前者影响的差异可及峰是后者的五倍。这些整合分析揭示了ccRCC的细胞结构，为ccRCC肿瘤发生中的关键标志物和通路提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ccRCC中肿瘤细胞特异性标志物及其表观遗传调控、空间异质性和关键通路是什么？BAP1与PBRM1突变如何影响染色质可及性和转录组？
- 核心机制
- CP高表达与透明变性间质和肿瘤-间质相互作用相关，可能通过调控COL4A1及OSM-OSMR、TGM2-FN1信号影响肿瘤微环境；KLF9可能调控CP和糖酵解基因转录；BAP1突变主要降低染色质可及性，PBRM1突变主要增加可及性，BAP1效应更广泛。
- 主要证据
- snRNA-seq/snATAC-seq识别20个肿瘤标志物；CP敲低Caki-1细胞RNA-seq显示基质体和炎症通路下调；空间转录组显示CP高表达区域与COL4A1富集共定位；BAP1突变肿瘤中84%的DACRs可及性降低，PBRM1突变中87%的DACRs可及性增加；SKRC-42 BAP1回补实验验证CES3表达。
- 研究意义
- 揭示ccRCC细胞结构，为诊断、预后和未来治疗（包括CAR-T疗法）提供候选肿瘤标志物，并为BAP1/PBRM1功能研究提供假设。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肿瘤细胞特异性标志物筛选与验证
识别ccRCC肿瘤细胞特异性标志物并验证其表达和表观遗传调控
通过4阶段流程：snRNA-seq比较肿瘤与非肿瘤细胞，排除近端小管和上皮细胞类型，snATAC-seq确认染色质可及性变化，bulk RNA-seq和蛋白质组学在更大队列验证；对CP和PCSK6进行免疫荧光染色验证。
CP功能与空间分布分析
探究CP在ccRCC中的分子功能及其与肿瘤-间质空间分布的关系
对2例ccRCC FFPE样本进行空间转录组（Visium，10x Genomics）；在Caki-1细胞中用shRNA敲低CP（sh-CP-C1、sh-CP-C2），bulk RNA-seq鉴定差异表达基因并进行通路富集；检测COL4A1、OSMR、TGM2表达。
转录因子调控验证
验证KLF9和MXI1对CP及糖酵解基因的转录调控
基于snATAC-seq motif分析提名KLF9调控CP、MXI1调控HK2、KLF9调控HK2/PFKP/ENO2；在RCC4细胞中用shRNA敲低KLF9或MXI1，Western blot和bulk RNA-seq检测靶基因表达。
肿瘤亚群异质性与EMT分析
解析瘤内肿瘤细胞亚群的转录组异质性、拷贝数差异及上皮/间质特征
对30例肿瘤样本的肿瘤细胞进行亚聚类（每簇>50细胞），基于snRNA-seq推断CNV；计算MSigDB Hallmark通路评分；定义Epi-H、Epi-M、Epi-L和EMT肿瘤亚群；免疫荧光验证VIM和WNT5A/B。
BAP1/PBRM1突变染色质可及性分析
解析BAP1和PBRM1突变对肿瘤细胞染色质可及性和转录组的影响
比较BAP1突变（4例）、PBRM1突变（9例）、双突变（2例）和无突变（8例）肿瘤细胞的snATAC-seq DACRs和snRNA-seq DEGs；在SKRC-42细胞系中进行BAP1回补实验验证CES3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
标志物表达与定位验证
基因功能敲低与验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞核提取 | 细胞核分离方案 | 10x Genomics | -- |
| SuperRNase抑制剂 | Invitrogen | -- | |
| 40微米滤网 | pluriSelect | -- | |
| FACS分选 | DRAQ5染料 | -- | -- |
| 7-AAD染料 | -- | -- | |
| snRNA-seq建库 | Chromium Next GEM单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| snATAC-seq建库 | Chromium Next GEM单细胞ATAC文库与凝胶珠试剂盒v1.1 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 空间转录组 | Visium空间基因表达载玻片 | 10x Genomics | CG000408 Rev A |
| Visium FFPE空间转录组脱蜡、H&E染色、成像和解交联方案 | 10x Genomics | CG000409 Rev A | |
| 免疫荧光 | CA9兔抗体 | Novus Bio | NB100-417 |
| CA9山羊抗体 | Invitrogen | PA5-47268 | |
| 波形蛋白鸡抗体 | Novus | NB300-223 | |
| WNT5a/b兔抗体 | Proteintech | 55184-1-AP | |
| 铜蓝蛋白山羊抗体 | Bethyl lab | A80-124A | |
| PCSK6兔抗体 | Invitrogen | PA5-32966 | |
| Alexa Fluor 488驴抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711-546-152 | |
| Alexa Fluor 488驴抗鸡二抗 | Jackson ImmunoResearch | 703-606-155 | |
| Alexa Fluor 488驴抗山羊二抗 | Jackson ImmunoResearch | 705-546-147 | |
| Alexa Fluor 594驴抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | 711-586-152 | |
| Alexa Fluor 594驴抗山羊二抗 | Jackson ImmunoResearch | 705-586-147 | |
| Alexa Fluor 647驴抗山羊二抗 | Jackson ImmunoResearch | 705-607-003 | |
| 免疫荧光显微镜 | Leica DMi8荧光显微镜 | Leica | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | 11320033 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F-9665 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| ViraPower慢病毒包装混合物 | Invitrogen | K497500 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
| shRNA敲低 | MISSION shRNA细菌甘油菌种 | Sigma-Aldrich | SHCLNG |
| MISSION pLKO.1-puro非哺乳动物shRNA对照质粒DNA | Sigma-Aldrich | SHC002 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | CST | 9806 |
| BTEB1（A-5）或KLF9抗体 | Santa Cruz | sc-376422 | |
| 铜蓝蛋白抗体 | Bethyl lab | A80-124A | |
| MXI1抗体 | Proteintech | 12360-1-AP | |
| β-微管蛋白（9F3）抗体 | Cell Signaling Technology | 2128S | |
| BAP1抗体 | Santa Cruz | sc-28383 | |
| β-肌动蛋白（8H10D10）抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| 支原体检测MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-20 | |
| PDX模型 | NSG小鼠 | The Jackson Laboratory | 005557 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2660 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10437028 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| snRNA-seq/snATAC-seq样本来源 | CPTAC ccRCC冰冻粉碎组织，snRNA-seq 34例（25例患者），snATAC-seq 28例（24例患者），含4例NAT；样本突变状态和免疫亚型经过平衡选择 阅读提示：Methods 'Human tissue specimens and clinical data'；Supplementary Data 1 |
| CP敲低实验 | Caki-1细胞，sh-CP-C1和sh-CP-C2两个构建体，对照sh-NT1和sh-NT2；MOI≈5；嘌呤霉素筛选浓度2 μg/ml；Polybrene 8 μg/mL 阅读提示：Methods 'Lentiviral infection for delivery of CP, MXI1, and KLF9 into RCC4 and Caki-1 cells'；Fig. 2b |
| KLF9/MXI1敲低实验 | RCC4细胞，sh-KLF9和sh-MXI1构建体，对照sh-NC；嘌呤霉素筛选浓度4 μg/ml；KLF9 Western blot 4次独立实验 阅读提示：Methods 'Lentiviral infection...'；Fig. 2i-k，Fig. 3f-g |
| 空间转录组 | 2例ccRCC FFPE样本，5 μm切片，Visium平台，探针杂交和S4 flow cell测序；CP高/低表达区域定义（A/B和C/D） 阅读提示：Methods 'FFPE Spatial transcriptomics specimen collection and preparation'；Fig. 2a |
| BAP1/PBRM1突变分组 | BAP1突变4例、PBRM1突变9例、双突变2例、无突变8例；仅纳入突变VAF>8%的样本（1例排除）；DACRs需FDR<0.05且在≥50%比较中一致 阅读提示：Results 'Chromatin accessibility changes in BAP1 and PBRM1 mutant tumors'；Fig. 6a；Supplementary Fig. 6a |