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          一日中的时间决定了NAD+治疗饮食诱导代谢疾病的效果，通过同步小鼠肝脏生物钟实现

        一日中的时间决定了NAD+治疗饮食诱导代谢疾病的效果，通过同步小鼠肝脏生物钟实现

        Time-of-day defines NAD+ efficacy to treat diet-induced metabolic disease by synchronizing the hepatic clock in mice.

        作者信息Quetzalcoatl Escalante-Covarrubias, Lucía Mendoza-Viveros, Mirna González-Suárez, Román Sitten-Olea, Laura A Velázquez-Villegas, Fernando Becerril-Pérez, Ignacio Pacheco-Bernal, Erick Carreño-Vázquez, Paola Mass-Sánchez, Marcia Bustamante-Zepeda, Ricardo Orozco-Solís, Lorena Aguilar-Arnal
        PMID36973248
        期刊Nat Commun
        发布时间2023-03-27
        DOI10.1038/s41467-023-37286-2
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        含饮食诱导肥胖小鼠模型、多种体内代谢表型验证、转录组分析和分子机制验证（Western blot、ChIP等）。

        主要模型

        C57Bl/6J雄性小鼠高脂饮食诱导肥胖模型 C57Bl/6J雌性小鼠（NAM治疗实验） 小鼠肝脏原代组织及分离线粒体

        重点核对

        NAD+剂量50 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续20天 注射时间ZT11（活动期前1小时）与ZT23（休息期前1小时）对比 高脂饮食喂养8周后开始治疗，治疗持续22天 葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）在ZT4和ZT16进行 肝脏NAD+水平用HPLC测定，生物钟蛋白用Western blot检测

        摘要

        生物钟是一个内源性时间跟踪系统，可预测每日环境变化。生物钟失调可导致肥胖，并伴随受生物钟控制、节律性代谢物NAD+水平降低。增加NAD+正成为代谢功能障碍的一种疗法；然而，每日NAD+波动的影响仍未知。在此，我们证明一日中的时间决定了NAD+治疗小鼠饮食诱导代谢疾病的效果。在肥胖雄性小鼠活动期之前增加NAD+可改善代谢指标，包括体重、葡萄糖和胰岛素耐受性、肝脏炎症和营养感知通路。然而，在休息期之前立即升高NAD+选择性地损害了这些反应。值得注意的是，定时NAD+调整了肝脏生物钟的昼夜节律振荡，当在休息期之前增加时，甚至完全倒置了其振荡相位，导致雄性和雌性小鼠的分子和行为节律错位。我们的发现揭示了基于NAD+疗法的时间依赖性，并支持基于时间生物学的治疗方法。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        每日NAD+波动是否影响NAD+治疗饮食诱导代谢疾病的效果，以及其与生物钟的关系。
        核心机制
        定时NAD+通过调整BMAL1对染色质的招募，同步肝脏生物钟的振荡相位；在活动期前增加NAD+维持生物钟相位并激活AMPK、AKT和mTOR等营养感知通路，而在休息期前增加NAD+则倒置肝脏生物钟相位，导致节律错位。
        主要证据
        在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，ZT11注射NAD+改善了体重、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、肝脏炎症和脂质代谢，而ZT23注射则效果较差或倒置了肝脏生物钟基因和蛋白的相位；ChIP分析显示BMAL1与染色质结合的时间依赖性改变。
        研究意义
        研究揭示了基于NAD+疗法的时间依赖性，支持基于时间生物学的NAD+治疗策略，为代谢疾病的时辰治疗提供依据。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立DIO小鼠模型并评估NAD+节律

        确认高脂饮食导致NAD+节律紊乱及NAD+治疗是否能恢复节律。

        小鼠喂食高脂饮食8周后，进行NAD+腹腔注射（50 mg/kg）或生理盐水，在ZT11或ZT23给药，持续20-22天；通过HPLC测定肝脏NAD+昼夜节律。

        2

        评估代谢表型和肝脏病理

        验证定时NAD+治疗对体重、葡萄糖稳态、胰岛素敏感性和肝脏脂质沉积的影响。

        测量体重、食物摄入、血清胰岛素、进行GTT和ITT；油红O染色评估肝脏脂肪变性；测定肝脏甘油三酯和血清甘油三酯。

        3

        转录组分析和机制探索

        揭示NAD+治疗引起的肝脏转录重编程及信号通路变化。

        对ZT6和ZT18肝脏进行微阵列分析，鉴定差异表达基因和富集通路；Western blot检测AKT、AMPK、mTOR等信号通路磷酸化；ChIP-qPCR分析BMAL1与染色质结合。

        4

        验证肝脏生物钟相位变化

        确定不同时间NAD+治疗对肝脏生物钟相位的影响及其与行为节律的关系。

        Western blot和RT-qPCR检测肝脏生物钟基因和蛋白的昼夜表达；监测小鼠活动和摄食行为；检测SCN中生物钟基因表达。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        高效液相色谱油红O染色苏木精-伊红染色
        验证细胞功能变化
        葡萄糖耐量试验胰岛素耐量试验脂肪酸氧化测定Seahorse细胞外流量分析
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹实时定量PCR微阵列分析
        验证免疫效应
        酶联免疫吸附测定
        验证机制链路
        染色质免疫沉淀基因集富集分析HOMER基序发现
        评估体内效果
        运动活动监测
        数据分析与统计
        双因素方差分析单因素方差分析CircWave节律分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        NAD+和NAM处理烟酰胺腺嘌呤二核苷酸SIGMAN7004
        NAM处理烟酰胺SIGMAN0636
        葡萄糖耐量试验D-葡萄糖SIGMAG7021
        胰岛素耐量试验人胰岛素Eli LillyHI0210
        甘油三酯测定甘油三酯比色测定试剂盒Cayman Chemical10010303
        游离脂肪酸测定游离脂肪酸荧光测定试剂盒Cayman Chemical700310
        血清胰岛素ELISA超灵敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒Crystal Chem Inc90080
        血清瘦素ELISA小鼠瘦素ELISA试剂盒Crystal Chem Inc90030
        肝脏胆固醇测定胆固醇定量试剂盒Sigma-AldrichMAK043
        油红O染色油红OSIGMAO1391
        RNA提取TRIzol试剂Invitrogen15596018
        cDNA合成iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad1708890
        实时定量PCR通用SYBR Green预混液Bio-Rad1725121
        mtDNA提取DNeasy血液和组织试剂盒QIAGEN69506
        Western blotPPARγ抗体Cell Signaling2443
        AKT抗体Cell Signaling9272
        磷酸化AKT Ser473抗体Cell Signaling9271
        AMPKα抗体Cell Signaling5831
        磷酸化AMPKα Thr172抗体Cell Signaling50081
        mTOR抗体Cell Signaling2893
        磷酸化mTOR Ser2448抗体Cell Signaling5536
        磷酸化p70 S6K Thr389抗体Cell Signaling9234
        磷酸化4E-BP1 Thr37/46抗体Cell Signaling2855
        RSK1/RSK2/RSK3抗体Cell Signaling9355
        磷酸化p90RSK Ser359抗体Cell Signaling8753
        REV-ERBα抗体Cell Signaling13418
        ULK1抗体Cell Signaling8054
        磷酸化ULK1 Ser555抗体Cell Signaling5869
        C/EBPα抗体Santa CruzSC-365318
        BMAL1抗体AbcamAb3350
        PER2抗体Alpha Diagnostics InternationalPER21-A
        CRY1抗体Bethyl LaboratoriesA302-614A
        α-微管蛋白抗体SigmaT5168
        GAPDH-HRP抗体GenetexGTX627408-01
        P84抗体GenetexGTX70220-01
        抗兔IgGCell Signaling7074
        抗鼠IgGSigmaI8765
        Immobilon Western化学发光HRP底物MilliporeWBKLS0100
        炎症细胞因子检测小鼠炎症ELISA条SignosisEA-1051
        ChIPDSG（二琥珀酰亚胺戊二酸酯）ProteoChem79642-50-5
        甲醛Sigma-AldrichF8775
        Magna ChIP蛋白G磁珠Sigma-Aldrich16-662
        正常小鼠IgGSigma-Aldrich18765

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        NAD+给药方案
        NAD+剂量50 mg/kg，腹腔注射，每日一次，给药时间ZT11或ZT23，治疗持续20-22天
        阅读提示：Methods: Chronotherapy with NAD+ and NAM
        动物模型与饮食
        C57Bl/6J小鼠，4周龄，高脂饮食8周后开始治疗，饮食成分（15%蛋白，53%脂肪，38%碳水化合物）
        阅读提示：Methods: Animals and diets
        代谢表型检测
        GTT（2 mg/kg葡萄糖，腹腔注射）和ITT（0.6 U/kg人胰岛素，腹腔注射）在ZT4和ZT16进行，禁食时间分别为12小时和5小时
        阅读提示：Methods: Glucose tolerance test (GTT) and insulin tolerance test (ITT)
        肝脏NAD+测定
        HPLC方法，组织处理（10% HClO4匀浆，中和，过滤），色谱条件（ZORBAX Eclipse XDB-C18柱，流动相梯度，检测波长261 nm）
        阅读提示：Methods: Detection and quantification of NAD+ by HPLC
        Western blot
        抗体稀释比例（如BMAL1 1:1000，GAPDH-HRP 1:120000），使用3-5生物学重复
        阅读提示：Methods: Western Blot
        ChIP
        双交联（2 mM DSG，1%甲醛），超声破碎条件（15 cycles，30s on/30s off），抗体用量（1.25 μL ab3350 + 2.5 μL ab93806）
        阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation (ChIP)

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