体外筛选着色剂对5-HT分泌的影响
比较常见合成着色剂对肠嗜铬细胞5-HT分泌的作用
用AR、BB、SY、TY处理BON细胞24小时，检测5-HT分泌和TPH1 mRNA
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长期暴露于合成食品着色剂诱惑红AC通过肠道5-羟色胺促进小鼠实验性结肠炎的易感性
Chronic exposure to synthetic food colorant Allura Red AC promotes susceptibility to experimental colitis via intestinal serotonin in mice.
实验完整度
高包含体外细胞、类器官、多种小鼠结肠炎模型、无菌小鼠菌群移植及TPH1/SERT敲除验证
主要模型
C57BL/6小鼠DSS诱导结肠炎模型 Rag1−/−小鼠CD4+CD45RBhi T细胞转移结肠炎模型 Tph1−/−和SERT−/−小鼠DSS结肠炎模型 无菌（GF）小鼠菌群移植模型 小鼠结肠类器官及2D单层 BON和HT-29细胞系
重点核对
AR经饮食给予100 ppm（0.1 g kg−1）或饮水0.01% w/v，持续12周或14周 DSS浓度2.0%或3.5% w/v，给药7天 TPH1缺失（Tph1−/−）小鼠中AR不影响DSS结肠炎易感性 无菌小鼠接受AR暴露小鼠盲肠菌群移植后结肠炎加重 AR处理浓度1 μmol L−1，TNF-α预处理10 ng mL−1 1小时
摘要
食品中的化学物质被广泛使用，导致人类大量暴露。诱惑红AC（AR）是一种非常常见的合成着色剂；然而，其对结肠炎的影响知之甚少。在此，我们表明，以常见消费膳食产品中发现的剂量长期暴露于AR会加剧小鼠实验性结肠炎模型。虽然间歇性暴露更类似于典型的人类暴露，但小鼠间歇性暴露于AR 12周并不会影响对结肠炎的易感性。然而，生命早期暴露于AR会使小鼠对结肠炎产生更高的易感性。此外，长期暴露于AR会诱导轻度结肠炎，这与结肠5-羟色胺（5-HT）水平升高和通过肌球蛋白轻链激酶（MLCK）损害上皮屏障功能有关。重要的是，长期暴露于AR不会影响缺乏色氨酸羟化酶1（TPH1）（5-HT生物合成的限速酶）的小鼠的结肠炎易感性。AR暴露扰动的肠道菌群盲肠转移会加重受体无菌（GF）小鼠的结肠炎严重程度。此外，长期AR暴露会升高naïve GF小鼠的结肠5-HT水平。虽然尚不清楚AR在人类中是否有类似作用，但我们的研究表明，长期暴露于一种常见的合成着色剂通过肠道菌群依赖和非依赖途径中的结肠5-HT促进小鼠实验性结肠炎。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 常见合成食品着色剂诱惑红AC（AR）是否影响实验性结肠炎的易感性及其机制。
- 核心机制
- 长期AR暴露通过升高结肠5-HT水平（依赖TPH1）和激活MLCK损害上皮屏障，并扰动肠道菌群，以菌群依赖和非依赖途径促进结肠炎；AR还通过ROS和NF-κB直接促进EC细胞5-HT分泌。
- 主要证据
- 多种小鼠结肠炎模型（DSS、T细胞转移）、Tph1−/−和SERT−/−小鼠、无菌小鼠菌群移植、类器官和细胞实验显示AR加重结肠炎并升高5-HT，而Tph1−/−小鼠中AR不加重结肠炎。
- 研究意义
- 揭示长期暴露于常见合成着色剂AR通过结肠5-HT促进小鼠实验性结肠炎，提示需进一步研究人类中类似效应及对其他食品染料的 scrutiny。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
长期AR暴露对DSS结肠炎的影响
验证长期AR暴露是否加剧DSS诱导的结肠炎
C57BL/6小鼠通过饮食暴露于AR 12周，随后给予3.5% DSS 7天，评估结肠炎指标
AR对T细胞转移结肠炎模型的影响
验证AR是否通过CD4+ T细胞促进结肠炎
Rag1−/−小鼠接受CD4+CD45RBhi T细胞腹腔注射，同时给予AR饮食5周
间歇性AR暴露对DSS结肠炎的影响
模拟典型人类间歇暴露，验证是否影响结肠炎易感性
C57BL/6小鼠每周间歇暴露AR饮食1天，持续12周，随后3.5% DSS 7天
生命早期AR暴露对DSS结肠炎的影响
验证生命早期AR暴露是否增加后期结肠炎易感性
4周龄C57BL/6小鼠暴露AR饮食4周，停止暴露后给予3.5% DSS 7天
AR诱导低度结肠炎及屏障功能机制
验证AR是否在无DSS情况下诱导低度炎症和屏障损伤，并涉及MLCK
C57BL/6小鼠暴露AR 14周，检测炎症指标、5-HT、MLCK/pMLC、ZO-1、Muc2；并用HT-29细胞和类器官验证
TPH1和SERT在AR效应中的作用
验证5-HT在AR加剧结肠炎中的中介作用
Tph1−/−和SERT−/−小鼠暴露AR 12周，随后3.5% DSS 7天，评估结肠炎
AR对肠道菌群的影响及菌群移植
验证AR扰动菌群是否足以加重结肠炎
16S rRNA测序分析AR暴露小鼠盲肠菌群；将菌群移植给GF小鼠，定植21天后2.0% DSS 7天
无菌小鼠中AR对5-HT和炎症的影响
验证AR在无菌群条件下是否仍能升高5-HT
GF小鼠暴露AR饮食14周，检测结肠5-HT、MPO和细胞因子
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 诱惑红AC | Toronto Research Chemical | -- |
| Teklad辐照全球18%蛋白啮齿动物饲料 | Teklad | 2918 | |
| 含诱惑红AC的定制饲料 | Teklad | TD.190960 | |
| DSS诱导结肠炎 | 葡聚糖硫酸钠 | ICN; Biomedicals Incorporate | -- |
| 流式分选 | EasySepTM小鼠初始CD4+ T细胞分离试剂盒 | StemCell Technology | -- |
| PE-cy7偶联抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | -- | |
| APC偶联抗小鼠CD4抗体 | BD Biosciences | -- | |
| FITC偶联抗小鼠CD45抗体 | BD Biosciences | -- | |
| FACS Aria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 粪便隐血检测 | Hemoccult II粪便隐血检测 | Beckman Coulter | -- |
| MPO测定 | 十六烷基三甲基溴化铵 | Sigma | -- |
| 邻联茴香胺 | Sigma | -- | |
| 混合研磨仪MM 400 | Retsch, Inc. | -- | |
| 细胞培养 | HT-29细胞 | ATCC | HTB-38 |
| Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 吲哚-3-甲醛 | -- | -- |
| 肿瘤坏死因子α | -- | -- | |
| 雷公藤内酯 | Tocris Biosciences | -- | |
| 5-羟色胺 | -- | -- | |
| 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | -- | -- | |
| 类器官培养 | 细胞回收液 | Corning | 354253 |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| N2添加剂 | Invitrogen | -- | |
| B27添加剂 | Invitrogen | -- | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠表皮生长因子 | Invitrogen | -- | |
| A83-01 | Tocris Biosciences | -- | |
| SB-202190 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Y-27632 | Abmole Biosciences | -- | |
| 单层培养 | TrypLE Express酶 | Gibco | -- |
| Geltrex基质胶 | Gibco | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop One/OneC微量紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| RT-qPCR | SsoFast EvaGreen预混液 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| ELISA | 5-HT酶联免疫吸附测定试剂盒 | Beckman Coulter | IM1749 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 蛋白定量 | DC蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 5000111 |
| ELISA | IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D Systems | SMLB00C |
| IL-6酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D Systems | SM6000B | |
| IFN-γ酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D Systems | MIF00 | |
| TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒 | R&D Systems | MTA00B | |
| Western blot | 抗pMLCSer19抗体 | Cell Signaling Technology | 3671 |
| 抗总MLC抗体 | Cell Signaling Technology | 3672 | |
| 抗ZO-1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
| 抗AhR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-133088 | |
| 抗兔辣根过氧化物酶标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗小鼠辣根过氧化物酶标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Abcam | ab65986 | |
| 免疫荧光 | 抗小鼠5-HT抗体 | Abcam | ab16007 |
| Alexa Fluor-568山羊抗小鼠IgG (H+L) | Life Technologies | A-11031 | |
| 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Molecular Probes, Invitrogen | -- | |
| 抗兔ZO-1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
| Alexa Fluor-488驴抗兔IgG (H+L) | Life Technologies | A-21206 | |
| LC-MS/MS | 台盼蓝 | -- | -- |
| Phenomenex Kinetex C18色谱柱 | Phenomenex | -- | |
| 16S rRNA测序 | 玻璃珠 | Mo-Bio | -- |
| Powerlyzer组织研磨器 | Mo-Bio | -- | |
| MagMAX核酸提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Illumina MiSeq测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AR暴露与DSS结肠炎模型 | AR剂量100 ppm饮食或0.01% w/v饮水；暴露时长12周或14周；DSS浓度3.5%或2.0% w/v，7天 阅读提示：Methods: Animals, DSS-induced colitis; Fig. 1a, Fig. 3a, Fig. 5a |
| T细胞转移结肠炎模型 | CD4+CD45RBhi T细胞分选纯度；腹腔注射5×10^5细胞；AR饮食100 ppm 5周 阅读提示：Methods: T cell-induced colitis; Fig. 2a |
| 无菌小鼠菌群移植 | 盲肠内容物pooled等量；200 μL灌胃每日一次连续3天；定植21天；2.0% DSS 7天 阅读提示：Methods: Cecal microbiota transfer; Fig. 6d |
| 类器官和细胞实验 | AR 1 μmol L−1处理24小时；TNF-α 10 ng mL−1预处理1小时；triptolide 20 nmol L−1预处理1小时 阅读提示：Methods: Cell culture, Generation of mouse colon organoids; Fig. 4d, Supplementary Fig. 9 |
| TPH1和SERT敲除小鼠实验 | Tph1−/−和SERT−/−小鼠背景；AR 100 ppm饮食12周；3.5% DSS 7天 阅读提示：Methods: Animals; Fig. 5a, Supplementary Fig. 14a |