筛选和鉴定ERK底物NELF-A
鉴定能被ERK磷酸化的新底物。
利用酵母三杂交系统筛选人cDNA文库，以LexA-WW为诱饵，共表达持续激活ERK(PD)，筛选His阳性克隆；并通过WW(W34A)突变验证磷酸化依赖性相互作用。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ERK介导的NELF-A磷酸化通过解除RNA聚合酶II启动子近端暂停促进即刻早期基因的转录延伸
ERK-mediated NELF-A phosphorylation promotes transcription elongation of immediate-early genes by releasing promoter-proximal pausing of RNA polymerase II.
实验完整度
高包含体外激酶实验、细胞系、小鼠移植瘤模型及患者肿瘤数据，有多层功能与机制验证
主要模型
HEK293细胞（NELF-A敲低并回补WT或4A） HaCaT细胞（NELF-A敲低并回补WT或4A） BALB/c nude小鼠皮下移植瘤模型 癌细胞系（A431、H1299、A375、A549）
重点核对
HEK293-WT与HEK293-4A细胞中EGF刺激前后IEGs表达比较（RNA-seq和qRT-PCR） HEK293-WT与HEK293-4A细胞中FOS和JUNB位点NELF-A与Pol-II的ChIP-qPCR HaCaT-WT与HaCaT-4A细胞中EGF诱导的cyclin D1、BrdU掺入和细胞增殖 BALB/c nude小鼠皮下注射HaCaT-WT或HaCaT-4A细胞后的肿瘤体积和重量 PP2A抑制剂（OA、cytostatin、rubratoxin A）和PP2A激活剂FTY720对NELF-A磷酸化的影响
摘要
生长因子诱导的、ERK介导的即刻早期基因（IEGs）诱导对细胞生长和肿瘤发生至关重要。尽管IEG表达主要受RNA聚合酶II（Pol-II）启动子近端暂停及其释放的转录延伸水平调控，但ERK在此过程中的作用仍不清楚。在此，我们将负延伸因子（NELF）-A鉴定为ERK底物。生长因子刺激后，ERK磷酸化NELF-A，使NELF从IEGs启动子近端区域暂停的Pol-II上解离，允许Pol-II恢复延伸并产生全长转录本。此外，我们发现在癌细胞中，PP2A有效去磷酸化NELF-A，从而防止ERK激活癌基因诱导的异常IEG表达。然而，当PP2A抑制蛋白过表达时（这在癌症中经常观察到），PP2A活性降低与癌基因介导的ERK激活协同诱导NELF-A磷酸化和IEG上调，导致肿瘤进展。我们的数据描绘了ERK和PP2A抑制蛋白在癌发生中先前未探索的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 生长因子诱导的IEGs转录延伸调控中，ERK是否通过磷酸化NELF-A发挥作用，以及PP2A如何调控该过程。
- 核心机制
- ERK磷酸化NELF-A的S363、S393、T396和T399位点，促使NELF从暂停的Pol-II上解离，释放Pol-II进入生产性延伸；PP2A去磷酸化NELF-A，拮抗ERK作用。
- 主要证据
- 体外激酶实验显示ERK直接磷酸化GST-NELF-A；Phos-tag SDS-PAGE和质谱鉴定磷酸化位点；HEK293和HaCaT细胞中NELF-A(4A)突变抑制IEG表达和Pol-II延伸；小鼠移植瘤模型中NELF-A(4A)降低肿瘤生长；癌细胞中PP2A抑制剂诱导NELF-A磷酸化和IEG表达。
- 研究意义
- 揭示ERK和PP2A抑制蛋白在癌发生中的新作用，提出PP2A活性是NELF-A磷酸化的关键决定因素，药理学重新激活PP2A可能抑制IEGs和生长促进基因表达。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ERK在体外和细胞内磷酸化NELF-A
确认ERK直接磷酸化NELF-A并鉴定磷酸化位点。
体外激酶实验：纯化HA-ERK2（野生型或K52N）与GST-NELF-A孵育，Pro-Q diamond染色检测磷酸化；细胞内共转染Flag-NELF-A和MEK1(DD)，用抗phospho-SP/TP抗体检测；使用MEK抑制剂trametinib和ERK抑制剂FR180204验证ERK依赖性；Phos-tag SDS-PAGE检测内源NELF-A磷酸化；质谱鉴定磷酸化位点。
建立NELF-A磷酸化缺陷细胞模型并验证IEG表达
验证ERK介导的NELF-A磷酸化对IEG表达的影响。
在HEK293和HaCaT细胞中敲低内源NELF-A，回补shRNA抗性的Myc-NELF-A(WT)或Myc-NELF-A(4A)；用EGF刺激后，通过RNA-seq和qRT-PCR检测IEGs表达，通过免疫印迹检测c-Fos和GADD45β蛋白。
检测NELF-A磷酸化对Pol-II暂停释放的影响
验证NELF-A磷酸化是否促进Pol-II从启动子近端暂停释放。
在HEK293-WT和HEK293-4A细胞中，EGF刺激前后，用ChIP-qPCR检测NELF-A和Pol-II在FOS和JUNB基因TSS及基因体区域的结合。
评估NELF-A磷酸化对细胞生长和肿瘤发生的影响
验证NELF-A磷酸化对细胞周期进程、增殖和体内肿瘤生长的作用。
在HaCaT-WT和HaCaT-4A细胞中，血清饥饿同步化后EGF刺激，检测cyclin D1表达、BrdU掺入和CCK8增殖；将细胞皮下注射到BALB/c nude小鼠，监测肿瘤体积和重量；使用H-Ras(G12V)转化的HaCaT细胞进行类似实验。
研究PP2A对NELF-A磷酸化的调控
确定PP2A是否是NELF-A去磷酸化的主要磷酸酶，并验证其在癌细胞中的作用。
在HeLa细胞中，TPA刺激后使用各种磷酸酶抑制剂（OA、cytostatin、rubratoxin A、FK506、sanguinarine、Na3VO4）和PP2A激活剂FTY720，通过Phos-tag SDS-PAGE监测NELF-A磷酸化；在HEK293细胞中共表达SET或CIP2A；体外磷酸酶实验使用重组PP2A；在癌细胞系（H1299、A375、A431、A549）中检测OA对NELF-A磷酸化的影响。
分析PP2A抑制蛋白与癌基因突变在临床样本中的关系
探究SET/CIP2A过表达与ERK激活癌基因突变在人类癌症中的共现及其对IEG表达和预后的影响。
利用TCGA-TARGET-GTEx和ICGC数据库分析SET/CIP2A表达与癌基因突变的关系，以及KRAS突变胰腺癌中SET/CIP2A与IEGs和生长促进基因表达的相关性；用Kaplan-Meier分析SET表达与胰腺癌患者总生存期的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和刺激 | 曲美替尼 | LC Laboratories | -- |
| AZD6244 | LC Laboratories | -- | |
| FR180204 | Cayman | -- | |
| DRB | Cayman | -- | |
| 冈田酸 | -- | -- | |
| FK506 | Wako | -- | |
| 细胞抑制素 | -- | -- | |
| 红霉素A | Institute of Microbiol Chemistry | -- | |
| 血根碱 | Cayman | -- | |
| 转染 | X-tremeGENE 9 DNA转染试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher | -- |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗Myc 9E10抗体 | Santa Cruz | sc-40 | |
| 蛋白G-Sepharose珠 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白G-Dynabeads | Thermo Fisher | -- | |
| 体外激酶实验 | 抗HA抗体 | Roche | 11867423001 |
| 体外磷酸酶实验 | 重组PP2A蛋白 | SignalChem | P16-20BH |
| 免疫印迹 | 抗NELF-A G-11抗体 | Santa Cruz | sc-365004 |
| 抗NELF-D C-10抗体 | Santa Cruz | sc-393972 | |
| 抗NELF-E F-9抗体 | Santa Cruz | sc-377052 | |
| 抗ERK1/2 C-9抗体 | Santa Cruz | sc-514302 | |
| 抗GST B-14抗体 | Santa Cruz | sc-138 | |
| 抗HA F-7抗体 | Santa Cruz | sc-7392 | |
| 抗Pol II 8WG16抗体 | Santa Cruz | sc-56767 | |
| 抗Pol II CTD4H8抗体 | Santa Cruz | sc-47701 | |
| 抗CDK9 D-7抗体 | Santa Cruz | sc-13130 | |
| 抗Elk1 E-5抗体 | Santa Cruz | sc-365876 | |
| 抗CyclinD1 A-12抗体 | Santa Cruz | sc-8396 | |
| 抗磷酸化Rpb1 CTD-Ser5 D9N5I抗体 | CST | 13523 | |
| 抗RSK1/RSK2/RSK3 32D7抗体 | CST | 9355 | |
| 抗磷酸化Rpb1 CTD-Ser2 E1Z3G抗体 | CST | 13499 | |
| 抗c-Fos 9F6抗体 | CST | 2250 | |
| 抗HA 3F10抗体 | Roche | 11867423001 | |
| 抗β-Actin抗体 | Wako | 010-27841 | |
| 抗His标签抗体 | Medical & Biological Laboratories | D291-3 | |
| 抗PP2Ac抗体 | BD | 610555 | |
| 抗DICE1/INTS6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376524 | |
| 抗MPM2（抗磷酸化SP或TP）抗体 | Millipore | 05-368 | |
| 抗ERK1 K-23抗体 | Santa Cruz | sc-94 | |
| 抗NELF-A抗体 | Protein tech | 10456-1-AP | |
| 抗NELF-B抗体 | Protein tech | 16418-1-AP | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | CST | 9101 | |
| 抗磷酸化p90RSK T573抗体 | CST | 9346 | |
| 抗GADD45B抗体 | Cloud-Clone | PAL535Hu01 | |
| 抗RAS（G12V突变体）抗体 | GeneTex | GTX132694 | |
| 抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶（HRP）抗体 | Cytiva | NA931 | |
| 抗兔IgG-HRP抗体 | Cytiva | NA934 | |
| Pro-Q diamond凝胶染色 | ProQ Diamond磷酸蛋白凝胶染色 | Thermo Fisher | -- |
| 银染 | SilverQuest银染试剂盒 | Invitrogen | -- |
| SYPRO Ruby染色 | SYPRO Ruby蛋白凝胶染色 | Thermo Fisher | -- |
| 质谱 | LTQ-Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| Dina-2A纳流液相色谱系统 | KYA Technologies | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa-488山羊抗小鼠抗体 | Molecular Probes | A-11029 |
| FluorSave封片剂 | Calbiochem | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Ion AmpliSeq转录组人基因表达试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| Ion PI Hi-Q测序200试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| Ion PI芯片v3 | Thermo Fisher | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| PrimeScript-RT预混液 | TaKaRa | -- | |
| Thunderbird SYBR qPCR预混液 | Toyobo | -- | |
| ChIP-qPCR | SimpleChIP酶法染色质IP试剂盒 | CST | -- |
| 抗Myc 9B11抗体 | CST | 2276 | |
| 小鼠对照IgG1 G3A1 | CST | 5415 | |
| 细胞增殖实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| 小鼠移植瘤实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| BrdU掺入实验 | 5-溴-2′-脱氧尿苷标记检测试剂盒I | Sigma-Aldrich | 11296736001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞刺激与抑制剂处理 | EGF浓度（20 ng/ml或60 ng/ml）、TPA浓度（300 nM）、trametinib（10 µM）、FR180204（40 µM）、OA（400 nM）等浓度和处理时间 阅读提示：Methods 'Cell culture and treatment'小节 |
| NELF-A磷酸化检测 | Phos-tag SDS-PAGE条件（50 μM Phos-tag acrylamide，0.1 mM MnCl2）、Pro-Q diamond染色步骤 阅读提示：Methods 'Phos-tag SDS-PAGE and Pro-Q diamond gel staining'小节及Figure 1、2图注 |
| ChIP-qPCR | 抗体用量（anti-Myc 9B11 0.4 µg/sample，anti-Pol II 4H8 2 µg/sample）、引物位置（TSS和基因体） 阅读提示：Methods 'ChIP-qPCR assay'小节及Figure 4图注 |
| 小鼠移植瘤实验 | 细胞数量（5×10^6）、小鼠品系（BALB/c-nude，5周龄雌性）、注射部位（皮下）、肿瘤体积测量公式、实验终点（36天或35天） 阅读提示：Methods 'Cell proliferation assay and mouse xenograft'小节及Figure 5图注 |
| BrdU掺入实验 | EGF刺激浓度（100 ng/ml）和时间（18 h）、BrdU浓度（10 µM）和孵育时间（1 h） 阅读提示：Methods 'BrdU incorporation assay'小节及Figure 5e图注 |