建立胞内感染模型并检测YAP亚细胞定位与活性
明确金黄色葡萄球菌感染是否改变YAP核转位及YAP-TEAD转录活性，以及EDIN-B的作用。
HEK293细胞按不同密度培养，以HG001、ST80 WT或ST80 ΔedinB感染，采用溶葡萄球菌素保护法限定胞内菌；免疫荧光定量YAP核/胞质MFI及NC比，荧光素酶报告检测TEAD活性，并检测ST80培养上清处理效应。
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YAP促进细胞自主免疫反应以清除胞内金黄色葡萄球菌的体外研究
YAP promotes cell-autonomous immune responses to tackle intracellular Staphylococcus aureus in vitro.
实验完整度
高含CRISPR突变HEK293细胞、滑膜类器官两种独立体系，并进行转录组、自噬流、溶酶体酸化及功能验证
主要模型
HEK293细胞（野生型、YAP−/−、YAPΔTEAD−/+） 人骨关节炎患者来源滑膜类器官（FLS构建）
重点核对
感染采用酶保护法：MOI 1或10感染2 h后加入10 µg/mL溶葡萄球菌素杀灭胞外菌 YAP−/−与YAPΔTEAD−/+细胞的YAP缺失及TEAD活性缺失经免疫印迹、RT-qPCR（CYR61）和荧光素酶报告验证 胞内菌量通过DsRed荧光体积显微定量及琼脂平板CFU计数评估 自噬流与溶酶体功能经LC3免疫印迹、CYTO-ID/SiR-Lysosome活细胞成像及LysoSensor酸化动力学检测 转录组用nCounter Host Response panel（770基因，n=3/组），FDR校正p<0.05
摘要
转录辅因子YAP/TAZ近期被发现支持自噬和炎症，二者属于细胞自主免疫的一部分，并在抗菌防御中至关重要。本文利用CRISPR/Cas9突变的HEK293细胞和原代细胞来源的类器官模型，研究YAP抗金黄色葡萄球菌的作用。我们发现金黄色葡萄球菌感染增加YAP转录活性，而该活性是减少胞内金黄色葡萄球菌复制所必需的。770基因靶向转录组分析显示，在感染和非感染条件下YAP均上调参与自噬/溶酶体和炎症通路的基因。YAP-TEAD转录活性促进自噬流和溶酶体酸化，二者对防御胞内金黄色葡萄球菌很重要。此外，葡萄球菌毒素C3外酶EDIN-B被发现在阻止YAP介导的细胞自主免疫反应方面有效。本研究为YAP抗金黄色葡萄球菌活性提供了关键见解，该活性可能保守用于防御其他胞内细菌。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YAP是否参与并如何调控细胞对胞内金黄色葡萄球菌的清除，以及细菌毒素EDIN-B是否通过抑制YAP利于其胞内复制。
- 核心机制
- 金黄色葡萄球菌感染诱导YAP核转位及YAP-TEAD转录活性，促进自噬/溶酶体基因（如ATP6V0D1、CTSL）和炎症介质表达，增强自噬流与溶酶体酸化从而限制胞内菌复制；EDIN-B通过抑制RhoA/YAP-TEAD活性削弱该细胞自主免疫反应。
- 主要证据
- 在HEK293细胞中，YAP缺失或TEAD结合域突变导致胞内金黄色葡萄球菌体积和CFU增加、自噬溶酶体增大及再酸化缺陷；nCounter转录组显示YAP−/−细胞炎症及自噬/溶酶体基因下调；滑膜类器官中ST80 ΔedinB诱导衬里层增厚和CTGF/CYR61、CXCL8、PTGS2表达，而EDIN-B表达株抑制这些反应。
- 研究意义
- 为YAP在细胞自主免疫中的作用提供关键基础见解，并揭示C3外酶EDIN-B在金黄色葡萄球菌感染中的作用，可能有助于寻找对抗胞内细菌的更有效途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证YAP-TEAD活性对胞内菌复制的功能作用
确定YAP-TEAD转录活性是否限制金黄色葡萄球菌胞内复制。
比较WT、YAP−/−和YAPΔTEAD−/+细胞中DsRed表达菌的胞内体积，并用琼脂平板CFU计数；另用C3外酶处理及ST80 WT/ΔedinB感染比较。
转录组分析YAP依赖的宿主反应基因
解析YAP调控的宿主反应基因及通路。
对WT和YAP−/−细胞在感染与非感染条件下用nCounter Host Response panel检测770个基因，进行差异表达和通路分析。
验证YAP对自噬流和溶酶体功能的影响
明确YAP-TEAD活性是否调控自噬流和溶酶体酸化。
免疫印迹检测LC3-I/II，活细胞共聚焦用CYTO-ID和SiR-Lysosome标记自噬囊泡和溶酶体，LysoSensor检测溶酶体再酸化动力学；并检测CQ、雷帕霉素处理效应。
验证感染期间自噬囊泡逃逸与细菌复制
分析YAP缺失时金黄色葡萄球菌逃逸自噬囊泡及胞内复制情况。
活细胞共聚焦同时标记CYTO-ID、SiR-Lysosome和DsRed菌，定量囊泡体积、菌与囊泡共定位及DsRed MFI；并用CQ处理WT和YAP−/−细胞比较胞内菌体积。
验证YAP对炎症反应的调控
明确YAP是否促进感染相关炎症介质表达。
nCounter炎症基因分析、RT-qPCR检测IL6、CXCL8、PTGS2、IL1B，ELISA检测上清IL-8。
在原代滑膜类器官中验证EDIN-B对YAP及炎症的影响
在更生理相关的3D原代细胞模型中验证EDIN-B抑制YAP转录活性及炎症介质表达。
用3名骨关节炎患者FLS构建滑膜类器官，感染ST80 WT或ΔedinB，活细胞共聚焦观察肌动蛋白和菌，冷冻切片免疫荧光检测YAP及衬里层厚度，RT-qPCR检测CTGF、CYR61、CXCL8、PTGS2。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达与转录活性
验证细胞功能与自噬/溶酶体状态
评估胞内细菌感染与复制
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸溶液 | -- | -- | |
| CRISPR-Cas9基因编辑 | Jet prime转染试剂 | Polyplus transfection | -- |
| 细菌培养与成像 | pSK265::DsRed质粒 | -- | -- |
| 细菌培养 | 血琼脂 | Biomérieux | 43049 |
| 胰蛋白酶大豆琼脂 | Becton Dickinson | 920241 | |
| 氯霉素 | -- | -- | |
| 类器官培养 | 无酚红基质胶 | Corning | 356237 |
| 96孔U形超低吸附板 | Corning | CLS4515 | |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒溶液 | -- | -- | |
| 类器官固定 | 乙二醛 | Sigma-Aldrich | 128465 |
| 感染实验 | 溶葡萄球菌素 | Ambicin, Ambi Products | -- |
| 胞内菌计数 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | -- | |
| EasySpiral Dilute自动平板接种仪 | Interscience | -- | |
| Scan 4000菌落计数器 | Interscience | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠IgG抗YAP抗体（63.7） | Santa Cruz Biotechnology | sc-101199 |
| 兔抗LC3A/B抗体 | Cell Signaling Technology | 4108 | |
| 小鼠和兔IgG同型抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31903 and 31235 | |
| 山羊抗小鼠488 | Thermo Fisher | A11034 | |
| 山羊抗兔488 | Thermo Fisher | A32731 | |
| 染料标记鬼笔环肽 | Abcam | ab176753 or ab176759 | |
| 活细胞成像 | 肉毒梭菌C3外酶 | Cytoskeleton | CT04 |
| CYTO-ID自噬检测试剂盒2.0 | Enzo Life Sciences | ENZ-KIT175 | |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| SiR-溶酶体探针 | Cytoskeleton | CY-SC012 | |
| SiR-肌动蛋白染料 | Cytoskeleton | -- | |
| 图像采集 | Ti2 CSU-W1转盘共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| CFI Plan Apo Lambda S 60x/1.40物镜 | Nikon | MRD1605 | |
| LSM 800 airyscan共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- | |
| Plan-Apochromat 10x/0.45 M27物镜 | Zeiss | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | 8xGTIIC荧光素酶质粒 | Addgene | 34615 |
| pRL-SVl40P质粒 | Addgene | 27163 | |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus transfection | -- | |
| Promega双荧光素酶检测试剂 | Promega | -- | |
| TriStar多功能酶标仪 | Berthold | -- | |
| 蛋白提取与免疫印迹 | Allprep RNA/蛋白提取试剂盒 | Qiagen | 80404 |
| 免疫印迹 | 8% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NW00082BOX |
| 16% Tris-Glycine凝胶 | Thermo Fisher Scientific | XP00162BOX | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Thermo Fisher Scientific | IB24002 | |
| YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| LC3A/B抗体 | Cell Signaling Technology | 12741 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | Thermo Fisher Scientific | 31460 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| ibright FL1500成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRI试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| Experion RNA分析试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| QuantIT RiboGreen RNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| iscript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| RT-qPCR | CFX96实时PCR系统 | Bio-Rad | -- |
| LightCycler FastStart DNA Master plus SYBR Green I | Roche Diagnostics | -- | |
| 溶酶体酸化检测 | CELLSTAR μClear 96孔板 | Greiner Bio-One | 655090 |
| 巴弗洛霉素A1 | -- | -- | |
| LysoSensor黄/蓝DND-160探针 | Thermo Fisher Scientific | L7545 | |
| Infinity 200多功能酶标仪 | Tecan | -- | |
| IL-8分泌检测 | IL-8酶联免疫吸附试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88-8086 |
| 转录组分析 | nCounter宿主反应基因面板 | Nanostring technology | -- |
| nCounter Sprint仪器 | Nanostring technology | -- | |
| 药物处理 | 氯喹 | -- | -- |
| 雷帕霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HEK293细胞培养与密度控制 | 低密度10,000 cells/cm2 24 h；中密度100,000 cells/cm2 24 h；高密度100,000 cells/cm2 72 h；纤连蛋白1:100包被2 h 阅读提示：Methods Cell culture |
| 金黄色葡萄球菌感染与胞外菌清除 | MOI 1或10；感染2 h；10 µg/mL溶葡萄球菌素；感染后3 h和7 h检测时间点 阅读提示：Methods Bacterial infection of HEK293 cells and organoids；Fig. 1A、Fig. 2图注 |
| YAP突变细胞验证 | YAP−/−与YAPΔTEAD−/+的sgRNA序列、同源重组供体及突变位点；YAP缺失和TEAD活性缺失的验证方法 阅读提示：Methods Cell line generation using CRISPR-Cas9 technology；Supplementary Fig. 1B、C、G |
| 自噬流与溶酶体功能检测 | CQ 50 µM 24 h；雷帕霉素500 nM 24 h；Bafilomycin A1处理2 h及20 min再酸化；CYTO-ID 1:500、SiR-Lysosome 1 µM、Hoechst 5 µg/mL 阅读提示：Methods Live-cell confocal microscopy、Measure of lysosomal acidification kinetic；Fig. 4图注 |
| 转录组分析 | nCounter Host Response panel 770基因；感染MOI 10、7 h；n=3/组；FDR校正p<0.05 阅读提示：Methods Transcriptomic analysis using nCounter Host Response Panel；Fig. 3、Fig. 6图注 |
| 滑膜类器官感染 | 3名骨关节炎患者FLS；每孔4×10^6 cells/mL Matrigel 22 µL；培养21天；感染1×10^8 S. aureus/mL；接触30 min或2 h震荡；10 µg/mL溶葡萄球菌素 阅读提示：Methods Organoid culture and processing、Bacterial infection of HEK293 cells and organoids；Fig. 7图注 |
| 炎症介质检测 | RT-qPCR以HPRT归一化，n=9/组；ELISA检测上清IL-8，n=9/组；7 hpi取样 阅读提示：Methods RNA extraction and RT-qPCR、Quantification of IL-8 secretion；Fig. 6C、D |