队列样本与DNA甲基化数据生成
获取高质量的全血DNA甲基化数据以评估群体变异。
采集Milieu Intérieur队列1000名健康成人全血，提取DNA，经亚硫酸氢盐转化后使用Infinium MethylationEPIC芯片检测>850,000个CpG位点，经质控后保留884名无亲缘关系个体和644,517个CpG位点。
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驱动人类血液DNA甲基化变异的免疫因素
The immune factors driving DNA methylation variation in human blood.
实验完整度
中基于884名成人队列，整合全血DNA甲基化芯片、流式免疫表型、基因分型及EWAS、中介分析和meQTL映射。
主要模型
Milieu Intérieur健康成人队列全血样本（884名无亲缘关系个体） 16种免疫细胞亚群（流式细胞术测定比例） 全血DNA甲基化图谱（644,517个CpG位点）
重点核对
队列样本：884名无亲缘关系健康成人，年龄20-69岁，男女各半 DNA甲基化检测：Illumina Infinium MethylationEPIC芯片，644,517个CpG位点通过质控 细胞组成：流式细胞术测定16种免疫细胞亚群比例 基因分型：5,699,237个SNP用于meQTL映射 统计校正：Bonferroni校正，Padj < 0.05
摘要
表观遗传变化是正常发育所必需的，但驱动人类表观遗传变异的因素的性质和各自贡献仍有待充分表征。在这里，我们评估了884名成年人的血液DNA甲基化组如何受到DNA序列变异、年龄、性别以及139个与生活习惯和免疫相关因素的影响。此外，我们通过深度免疫表型分析测量细胞组成，研究了这些效应是否由细胞组成变化所介导。我们发现，初始和记忆T细胞之间的DNA甲基化存在显著差异，支持了对这些细胞类型进行调整的必要性。通过这样做，我们发现潜伏性巨细胞病毒感染驱动DNA甲基化变异，并进一步支持衰老过程中DNA甲基化离散度的增加是由于表观遗传漂变。最后，我们的结果表明，细胞组成和DNA序列变异是DNA甲基化的最强预测因子，突出了医学表观基因组学研究中的关键因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究DNA序列变异、年龄、性别及139个生活习惯和免疫相关因素如何影响人类血液DNA甲基化组，以及这些效应是否由细胞组成变化介导。
- 核心机制
- 潜伏性巨细胞病毒感染主要通过改变初始和记忆CD4+及CD8+ T细胞比例驱动DNA甲基化变异；衰老过程中DNA甲基化离散度增加与细胞组成无关，可能反映表观遗传维持机制保真度下降。
- 主要证据
- 对884名成人血液DNA甲基化组分析发现，细胞组成和DNA序列变异是DNA甲基化最强预测因子；CMV血清状态与79,654个CpG位点总效应相关，其中85,922个位点效应由细胞组成介导；衰老与20,140个CpG位点甲基化离散度增加相关。
- 研究意义
- 研究结果强调在医学表观基因组学研究中需考虑细胞组成、年龄、性别、CMV感染、吸烟和慢性低度炎症等关键因素，并为理解健康衰老和环境因素在人类疾病中的作用提供新假设。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
免疫细胞组成深度表型分析
量化16种免疫细胞亚群比例，用于区分DNA甲基化的直接效应和细胞组成介导效应。
使用流式细胞术测定所有供者16种免疫细胞亚群比例，包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、NK细胞、树突状细胞、B细胞、CD4-CD8- T细胞以及初始、中央记忆、效应记忆和终末分化效应记忆CD4+和CD8+ T细胞。
细胞组成与DNA甲基化关联分析
确定哪些免疫细胞群体最影响DNA甲基化变异。
使用包含细胞亚群对数比的多变量回归模型量化16种血细胞亚群间5mC水平差异，并通过模拟和与分选细胞亚群独立DNA甲基化数据比较验证模型准确性。
141个候选因素的EWAS及中介分析
评估年龄、性别、CMV血清状态、吸烟等非遗传因素对DNA甲基化的总效应、直接效应和细胞组成介导效应。
对141个候选因素进行EWAS，使用线性混合模型调整批次变量、遗传因素、遗传祖先、吸烟状态、性别和非线性年龄项，分别估计总效应（不调整细胞比例）、直接效应（调整16种测得细胞比例）和介导效应（中介分析）。
细胞混合物解卷积方法比较
评估第一代解卷积方法是否能充分区分直接效应和细胞组成介导效应。
比较基于流式细胞术数据调整的EWAS与基于Houseman、IDOL和EPIC IDOL-Ext三种解卷积方法估计细胞比例调整的EWAS结果。
CMV感染对DNA甲基化组影响的机制分析
探究CMV感染影响DNA甲基化的机制，包括细胞组成介导效应和直接效应。
分析CMV血清状态的总效应、介导效应和直接效应，鉴定差异甲基化位点的基因组分布和转录因子结合位点富集，构建基于DNA甲基化的CMV血清状态预测模型。
衰老相关DNA甲基化变化及表观遗传漂变分析
解析衰老对DNA甲基化的直接效应、细胞组成介导效应和离散度变化。
分析年龄的直接效应和介导效应，鉴定与衰老相关的染色质状态和转录因子结合位点富集，使用残差方差随年龄线性变化的模型检测DNA甲基化离散度随年龄的变化。
性别差异及基因×环境交互分析
评估性别对DNA甲基化的影响以及基因型与年龄、性别、吸烟、CMV和CRP水平的交互效应。
分析性别的总效应、直接效应和介导效应，检测性别与年龄交互效应，进行局部和远程meQTL映射，检验基因型×年龄、基因型×性别、基因型×吸烟、基因型×CMV、基因型×CRP交互效应。
DNA甲基化变异预测因素相对贡献评估
比较细胞组成、遗传因素、内在因素和环境暴露对DNA甲基化变异的相对预测能力。
将因素分为细胞组成、内在因素（年龄和性别）、遗传因素和环境暴露四组，通过交叉验证估计各组的样本外预测方差解释比例，并评估基因×环境交互项的额外预测能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | Nucleon BACC3基因组DNA提取试剂盒 | Cytiva | RPN8512 |
| DNA甲基化检测 | EZ DNA甲基化试剂盒 | Zymo Research | D5001 |
| Infinium MethylationEPIC芯片 | Illumina | WG-317-1003 | |
| 流式细胞术 | MACSQuant分析仪 | Miltenyi | -- |
| MACSQuant校准微球 | Miltenyi | -- | |
| 基因分型 | HumanOmniExpress-24芯片 | Illumina | -- |
| HumanExome-12芯片 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 队列样本与DNA甲基化数据生成 | 样本来源：Milieu Intérieur队列884名无亲缘关系健康成人；年龄20-69岁，男女各半；DNA甲基化芯片：Infinium MethylationEPIC；质控后CpG位点数：644,517 阅读提示：Methods 'The Milieu Intérieur cohort'、'DNA sampling and extraction'、'DNA methylation profiling and data quality controls' |
| 免疫细胞组成深度表型分析 | 细胞亚群数：16种；检测方法：流式细胞术；使用的流式 panels 和抗体详见参考文献25 阅读提示：Methods 'Flow cytometry' |
| 141个候选因素的EWAS及中介分析 | 候选因素数：141个；协变量：年龄（3自由度自然样条）、性别、CMV血清状态、吸烟状态、局部显著SNP、独立远程SNP、基因型前两个主成分；随机效应：采血日期；显著性阈值：Bonferroni校正Padj < 0.05 阅读提示：Methods 'Epigenome-wide association studies of non-genetic factors' |
| 细胞混合物解卷积方法比较 | 比较方法：Houseman、IDOL、EPIC IDOL-Ext；参照：流式细胞术测得16种细胞比例；解卷积估计的细胞类型数：6种（Houseman、IDOL）或12种（EPIC IDOL-Ext） 阅读提示：Methods 'The direct effects adjusted by deconvolution methods' |
| CMV感染对DNA甲基化组影响的机制分析 | CMV血清状态定义：文中未明确说明；预测模型：弹性网回归，10折交叉验证；交叉验证重复次数：5次重复2维交叉验证 阅读提示：Methods 'Prediction of CMV serostatus' |
| 衰老相关DNA甲基化变化及表观遗传漂变分析 | 年龄项：3自由度自然样条；离散度模型：残差方差随年龄线性变化；显著性检验：似然比检验；敏感性分析：额外调整细胞组成 阅读提示：Methods 'Detection of the dispersion of DNA methylation with age' |
| 性别差异及基因×环境交互分析 | 局部meQTL窗口：CpG位点周围100-Kb；远程meQTL窗口：CpG位点1-Mb窗口外；交互检验：Wald检验，异方差稳健标准误；显著性阈值：Bonferroni校正Padj < 0.05 阅读提示：Methods 'Local meQTL mapping analyses'、'Remote meQTL mapping analyses'、'Detection of gene × environment interactions' |
| DNA甲基化变异预测因素相对贡献评估 | 交叉验证方案：5折交叉验证重复4次；分组：细胞组成（16种细胞比例）、内在因素（年龄和性别）、遗传因素（每个CpG位点最相关局部meQTL变异）、环境暴露（吸烟、CMV血清状态、CRP水平） 阅读提示：Methods 'Estimation of proportions of explained 5mC variance' |