TET条件敲除小鼠骨骼表型分析
验证TET家族基因在体内骨骼发育中的功能及功能冗余性。
将Prx1-Cre小鼠与Tet1fl/flTet2fl/flTet3fl/fl小鼠杂交获得TCKO及保留单个等位基因的小鼠，进行整体骨骼染色、骨长度测量和μ-CT分析。
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TET酶通过增加RUNX2靶基因的染色质可及性调控骨骼发育
TET enzymes regulate skeletal development through increasing chromatin accessibility of RUNX2 target genes.
实验完整度
高包含条件敲除小鼠模型、原代成骨/软骨细胞体外功能验证及RNA-seq/WGBS/ATAC-seq等多组学机制验证
主要模型
Prx1-Cre介导的Tet1/2/3条件敲除小鼠 小鼠颅骨来源原代成骨细胞 小鼠关节软骨来源原代软骨细胞 HEK293T细胞
重点核对
TCKO小鼠在P0进行Alcian blue-Alizarin red S整体骨骼染色及骨长度定量 原代成骨细胞诱导分化7天ALP活性和21天茜素红钙结节检测 WGBS和ATAC-seq分析TCKO成骨细胞中hyper-CG-DMR与染色质可及性变化 RUNX2 ChIP-qPCR检测Col1α1、Col1α2和Alpl启动子区富集 Co-IP验证TET1/2/3催化结构域与RUNX2的直接相互作用
摘要
Ten-eleven translocation (TET) 家族双加氧酶通过催化5-甲基胞嘧啶 (5mC) 氧化介导胞嘧啶去甲基化。TET介导的DNA去甲基化控制胚胎干细胞的正确分化，且TET成员在原肠胚形成早期表现出功能冗余。然而，尚不清楚TET蛋白在哺乳动物骨骼发育中是否具有功能意义。在此，我们报道中胚层间充质干细胞中Tet基因缺陷导致严重的骨发育缺陷。任何一个Tet基因等位基因的存在均可支持早期骨形成，提示TET蛋白的功能冗余。对RNA-seq、全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS)、5hmC-Seal和转座酶可及染色质测定 (ATAC-seq) 的整合分析表明，TET介导的去甲基化增加了RUNX2靶基因的染色质可及性，并促进RUNX2调控的转录。此外，TET蛋白通过其催化结构域与RUNX2相互作用，调节RUNX2结合区域周围的胞嘧啶甲基化。催化结构域对于TET酶调节RUNX2对其靶基因的转录活性以及调节骨发育是必不可少的。这些结果表明TET酶发挥调节RUNX2活性和维持骨骼稳态的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TET蛋白在哺乳动物骨骼发育中是否具有功能，以及其是否通过调控RUNX2靶基因影响骨形成。
- 核心机制
- TET蛋白通过催化结构域与RUNX2相互作用，介导RUNX2结合区域周围DNA去甲基化，增加靶基因染色质可及性，从而促进RUNX2调控的成骨基因转录。
- 主要证据
- Prx1-Cre介导的Tet1/2/3条件敲除小鼠出现颅缝延迟闭合、锁骨发育不良和长骨缩短；原代成骨细胞成骨分化受损；RNA-seq、WGBS、5hmC-Seal、ATAC-seq和RUNX2 ChIP-seq整合分析显示RUNX2靶基因启动子高甲基化、染色质可及性降低；Co-IP和GST pull-down证实TET与RUNX2直接互作。
- 研究意义
- 本研究揭示TET介导的DNA去甲基化对维持胚胎骨形成不可或缺，扩展了对DNA甲基化调控RUNX2调节骨发育的理解，并推进了临床诊断认识。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TET缺失对成骨与软骨分化的影响
验证TET缺失是否损害膜内成骨和软骨内成骨过程。
分离WT和TCKO小鼠颅骨原代成骨细胞及软骨细胞，进行诱导分化，检测ALP活性、钙结节形成及成骨/软骨标志基因表达；对小鼠骨组织进行Von-kossa染色和免疫荧光。
TET催化结构域依赖性验证
验证TET调控骨形成是否依赖其双加氧酶催化活性。
在Tet缺失成骨细胞中过表达TET1/2/3催化结构域(CD)或酶失活突变体(HD)，检测成骨分化恢复情况；构建Prx1-Cre, Tet1fl/HDTet2fl/flTet3fl/fl小鼠进行体内验证。
多组学联合分析揭示TET调控染色质可及性
阐明TET缺失如何影响成骨细胞转录组、DNA甲基化及染色质状态。
对WT和TCKO原代成骨细胞进行RNA-seq、WGBS、5hmC-Seal和ATAC-seq，整合分析差异表达基因、差异甲基化区域和染色质开放区域。
TET与RUNX2相互作用及功能协同验证
验证TET蛋白是否通过催化结构域与RUNX2直接互作并协同促进成骨。
在293T细胞中进行Co-IP和GST pull-down验证TET与RUNX2互作；在成骨细胞中共表达Tet2和Runx2检测协同成骨效应；使用ChIP-qPCR检测RUNX2和RNA Pol II在靶基因启动子的富集。
RUNX2靶基因启动子甲基化验证
验证TCKO成骨细胞中RUNX2靶基因启动子区高甲基化。
采用亚硫酸氢盐Sanger测序检测Alpl、Col1α1和Col1α2启动子区甲基化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
验证转录调控与染色质结合
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原代成骨细胞分离 | 胶原酶 | Sigma | C0130 |
| 中性蛋白酶II | Sigma | D4693 | |
| α-MEM培养基 | Corning | -- | |
| 成骨诱导分化 | L-抗坏血酸 | Sigma | A5960 |
| β-甘油磷酸二钠盐水合物 | Sigma | G9422 | |
| ALP染色 | BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 | Beyotime | C3206 |
| ALP活性定量 | 阿尔玛蓝 | Thermo | 88951 |
| 磷酸酶底物 | Sigma | S0942 | |
| 钙结节染色 | 茜素红S | -- | -- |
| 免疫共沉淀 | 抗Flag磁珠 | Sigma | A2220 |
| 抗HA磁珠 | AOGMA | AGM90054 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0010 | |
| Western blot | HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 |
| Flag抗体 | Sigma | F3165-5MG | |
| 抗小鼠免疫球蛋白/HRP | Abbkine | A2502 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗OPN抗体 | R&D Systems | AF808 |
| 兔抗BGLAP抗体 | ABCAM | ab93876 | |
| 兔抗RUNX2抗体 | ABCAM | ab236639 | |
| 小鼠抗5mC抗体 | ABCAM | ab10805 | |
| 兔抗5hmC抗体 | active motif | 39792 | |
| 兔抗Col10a1抗体 | Abclonal | a6889 | |
| 兔抗Mmp13抗体 | Proteintech | 18165-1-AP | |
| 兔抗Osx抗体 | ABCAM | ab22552 | |
| 生物素抗PCNA抗体 | Biolegend | 307904 | |
| 兔抗Cleaved-Caspase3抗体 | CST | 9664T | |
| 驴抗小鼠488 | Molecular Probes | A21202 | |
| 驴抗山羊488 | Molecular Probes | A11055 | |
| 驴抗兔cy3 | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| APC-链霉亲和素 | BioLegend | 405207 | |
| DAPI | Sigma | D8417 | |
| 抗荧光封片剂 | Dako | S3023 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | |
| RT-qPCR | TRIzol | Sigma | T9424 |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | TakaRa | PR037A | |
| ChIP | Magna ChIP A/G试剂盒 | Millipore | 17-10085 |
| RNA聚合酶II抗体 | Millipore | 05-623 | |
| 正常IgG | Millipore | 12-371 | |
| 亚硫酸氢盐测序 | EZ DNA甲基化直接试剂盒 | Zymo Research | D5005 |
| 凝胶回收试剂盒 | Hling | HDP202-02 | |
| pGEM-T Easy载体 | Promega | A1360 | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖4B | GE Healthcare | 17-0756-01 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1960 |
| RNA-seq | DNeasy血液与组织试剂盒 | QIAGEN | 69504 |
| ATAC-seq | TruePrep DNA文库制备试剂盒V2 | Vazyme | TD501 |
| DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo | D4014 | |
| VAHTS DNA纯化磁珠 | Vazyme | N411-00-AA | |
| Edu染色 | Cell-Light Apollo 488染色试剂盒 | RIBOBIO | C10371-3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠骨骼表型分析 | 小鼠品系背景为C57BL/6；TCKO构建使用Prx1-Cre与Tet1fl/flTet2fl/flTet3fl/fl杂交；观察时间点包括P0、P10及E15.5至P0；每组至少3只小鼠（WT n=7，TCKO n=5，部分基因型n=3-4）。 阅读提示：Methods中Mouse lines小节及Fig. 1、Fig. 3图注 |
| 原代成骨细胞分离与诱导分化 | 小鼠年龄为出生后3-5天；消化使用1 mg/ml collagenase和2 mg/ml Dispase II，每次10分钟共4次；成骨诱导培养基含50 μg/ml L-ascorbic acid和1.08 mg/ml β-Glycerophosphate；ALP染色在诱导7天，茜素红染色在诱导21天。 阅读提示：Methods中Cell culture小节 |
| 多组学测序 | 细胞为3日龄WT和TCKO小鼠原代成骨细胞，培养3天后收集；RNA-seq每组3个重复；WGBS每组1个样本；ATAC-seq使用1×10^5个细胞；DMR定义为200 bp窗口内至少4个CG位点、甲基化差异>40%、FDR<0.05。 阅读提示：Methods中RNA sequencing、GBS、5hmC-Seal sequencing及Next generation sequencing data analysis小节 |
| Co-IP与GST pull-down | Co-IP在HEK293T细胞中转染Flag-TET1/2/3全长或CD结构域与HA-RUNX2，48小时后裂解；使用anti-Flag beads或anti-HA beads孵育3-4小时或过夜；GST pull-down使用纯化的GST-RUNX2与Flag-TET2-CD在EBC缓冲液中4°C孵育3-4小时。 阅读提示：Methods中Immunoprecipitation和In vitro binding assays小节及Fig. 6图注 |
| ChIP-qPCR | 使用1×10^6个WT或TCKO成骨细胞；1%甲醛固定10分钟；RUNX2抗体用量3 μg/1×10^6细胞，Pol II抗体3 μg/1×10^6细胞，Normal IgG为阴性对照；qPCR检测Col1α1、Col1α2和Alpl启动子区。 阅读提示：Methods中ChIP assays小节及Fig. 7图注 |
| 亚硫酸氢盐Sanger测序 | 基因组DNA使用EZ DNA Methylation-Direct Kit处理；PCR产物克隆至pGEM-T Easy Vector后测序；检测Alpl、Col1α1和Col1α2启动子区。 阅读提示：Methods中Conventional bisulfite sequencing小节及Supplementary Fig. 9f-h |