PCGF6敲除人PSCs的建立与多能性维持分析
确定PCGF6缺失是否影响人PSCs的多能性维持。
利用CRISPR-Cas9在PGP1中靶向第一外显子敲除PCGF6，获得两个纯合克隆；通过基因组PCR、qRT-PCR和Western blot验证；检测形态、碱性磷酸酶活性、细胞周期、增殖及多能性标志物OCT4和NANOG；通过免疫共沉淀检测PRC1.6复合物完整性。
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PCGF6通过激活SOX2表达控制人类多能干细胞的神经外胚层特化
PCGF6 controls neuroectoderm specification of human pluripotent stem cells by activating SOX2 expression.
实验完整度
高包含CRISPR敲除、RNA-seq、ChIP-seq、回补与报告基因等多层功能与机制验证
主要模型
人类诱导多能干细胞系PGP1（PCGF6-KO） 人类胚胎干细胞系H9（SRE-KO） HEK293T细胞 PCGF6-KO人PSCs的神经外胚层分化模型
重点核对
PCGF6-KO克隆：KO#1为178 bp双等位缺失，KO#2为203 bp双等位缺失 SRE-KO：使用两对gRNA删除SOX2调控元件，获得H9背景SRE-KO亚克隆 PCGF6回补：在PCGF6-KO PSCs中重新表达PCGF6 SOX2回补：在PCGF6-KO PSCs中慢病毒过表达SOX2 MYC敲低：使用shMYC#1和shMYC#2慢病毒载体
摘要
Polycomb group（PcG）蛋白已知在胚胎发育和组织稳态中抑制发育基因。在这里，我们报道PCGF6通过激活SOX2基因控制人类多能干细胞（PSCs）的神经外胚层特化。PCGF6敲低的人类PSCs显示神经外胚层分化受损，同时中内胚层结果增加。转录组分析揭示WNT/β-catenin信号通路的去抑制是PSC向中内胚层谱系分化的原因。有趣的是，PCGF6和MYC直接相互作用并共同占据SOX2的远端调控元件以激活SOX2表达，这可能解释了神经外胚层分化中的调控。支持这一观点的是，SOX2调控元件的基因组缺失模拟了受损的神经外胚层分化，而过表达SOX2挽救了PCGF6敲低引起的神经外胚层表型。总之，我们的研究揭示PCGF6通过抑制和激活机制，可以作为人类PSCs中中内胚层和神经外胚层之间的谱系切换器。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PCGF6在人类多能干细胞谱系特化中是否发挥作用，以及其分子机制如何？
- 核心机制
- PCGF6一方面通过PRC1.6复合物依赖的方式抑制WNT/β-catenin信号基因，限制中内胚层分化；另一方面与MYC相互作用并招募MYC至SOX2远端调控元件SRE，激活SOX2转录，促进神经外胚层分化。
- 主要证据
- PCGF6-KO人PSCs在EB和定向分化中中内胚层标志物升高、神经外胚层标志物降低；RNA-seq、ChIP-seq和ChIP-qPCR显示PCGF6结合并抑制WNT基因；PCGF6与MYC互作并共占SRE；SRE缺失模拟PCGF6-KO表型，SOX2过表达部分挽救神经外胚层分化缺陷。
- 研究意义
- 揭示了PCGF6作为谱系切换器在人类PSCs早期谱系决定中的双重功能，为理解PcG蛋白在细胞命运决定和胚胎发育中的多样功能提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PCGF6缺失导致基因表达异常与自发分化倾向
解析PCGF6缺失对转录组和谱系分化的影响。
对WT和PCGF6-KO人PSCs进行RNA-seq，鉴定差异表达基因并进行GO分析；通过EB形成实验和qRT-PCR检测9天EB中多能性及三胚层标志物。
PCGF6通过PRC1.6抑制WNT/β-catenin信号基因
验证PCGF6是否直接抑制WNT信号基因并解释中内胚层偏向。
进行GSEA和KEGG分析；PCGF6 ChIP-seq与RNA-seq整合；Western blot检测活性β-catenin；7xTCF荧光素酶报告基因；ChIP-seq检测PCGF6、RYBP、RING1B、MAX、E2F6和H2AK119ub在WNT基因启动子的富集；ChIP-qPCR检测RING1B、EHMT2和HDAC1富集。
PCGF6正向调控SOX2促进神经外胚层分化
确定PCGF6是否通过SOX2调控神经外胚层分化。
检测神经分化过程中PCGF6表达；qRT-PCR和Western blot验证SOX2表达；使用双SMAD抑制神经外胚层分化方案，在day 0、3、5、7进行qRT-PCR，day 3和7进行免疫荧光；在PCGF6-KO中回补PCGF6或过表达SOX2，检测神经标志物SOX1和PAX6。
PCGF6与MYC互作并激活SOX2转录
揭示PCGF6激活SOX2的分子机制。
分析PCGF6 ChIP-seq在SOX2基因下游约10 kb的SRE结合；ChIP-qPCR验证；CRISPR/Cas9删除SRE并检测SOX2表达及神经分化；免疫共沉淀和GST/His pull-down验证PCGF6与MYC互作；ChIP-qPCR检测MYC在SRE的结合；MYC敲低后检测SOX2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354277 |
| mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| 细胞传代 | Accutase细胞消化液 | STEMCELL Technologies | 07922 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 10100147 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378016 | |
| 细胞传代 | 0.05%胰蛋白酶 | Gibco | 25300120 |
| 电转 | pX459载体 | -- | -- |
| 电转后培养 | Y-27632 | Selleck | S1049 |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Santa Cruz Biotechnology | 58582 |
| 流式分选 | FACSAria III流式细胞分选仪 | BD | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693116001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Science | A53225 | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | Z746010 | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 抗PCGF6抗体 | Proteintech | 24102-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-l-lg | |
| 抗α-Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗OCT4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| 抗SOX2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-20088 | |
| 抗NANOG抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-33759 | |
| 抗MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 13987S | |
| 抗EHMT2抗体 | Proteintech | 66689-1-Ig | |
| 抗L3MBTL2抗体 | Proteintech | 39570 | |
| 抗MAX抗体 | Proteintech | 10426-1-AP | |
| 抗RYBP抗体 | Proteintech | 11365-1-AP | |
| 抗E2F6抗体 | ABclonal | A2718 | |
| 抗HDAC1抗体 | Proteintech | 10197-1-AP | |
| 免疫荧光 | 抗PAX6抗体 | Biolegend | l901301 |
| 抗SOX1抗体 | Cell Signaling Technology | 4195S | |
| 抗OCT4抗体 | Santa Cruz biotechnology | sc-5279 | |
| 抗NANOG抗体 | Cell Signaling Technology | 4903 | |
| 抗PDX1抗体 | abcam | ab47267 | |
| 抗T/Brachyury抗体 | Cell Signaling Technology | 81694S | |
| 抗TUJ1抗体 | SIGMA | T3952 | |
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| 内胚层分化 | Activin A | PeproTech | 120-14P |
| DMEM-F12培养基 | Gibco | C11330500BT | |
| 牛血清白蛋白 | YEASEN | B57370 | |
| 心肌细胞分化 | CHIR99021 | Selleck | S2924 |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | C11875500BT | |
| 神经外胚层分化 | N2添加剂 | BasalMedia | S430J4 |
| B27添加剂 | BasalMedia | S441J7 | |
| SB431542 | Selleck | S1067 | |
| LDN193189 | Selleck | 7507 | |
| 神经元分化 | BDNF | MCE | HY-P7116A |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| 流式细胞术 | TrypLE Express细胞消化液 | Gibco | 12604013 |
| APC标记小鼠抗人CD184抗体 | BD | 555976 | |
| APC标记小鼠同型IgG | BioLegend | 400220 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman | -- | |
| qRT-PCR | HiPure总RNA小量提取试剂盒 | Magen | R4111-03 |
| ABScript II逆转录预混液 | ABclonal | RK20402 | |
| 2×SYBR Green qPCR预混液 | Biomake | B21203 | |
| C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G Dynabeads | -- | -- |
| 抗RING1B抗体 | Cell Signaling Technology | 5694 | |
| ChIP-seq | 抗H2AK119Ub抗体 | Cell Signaling Technology | 8240 |
| Diagenode Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| 荧光素酶报告基因实验 | Sage Lipoplus DNA转染试剂 | Sage | Q03004 |
| 荧光素酶检测试剂盒 | Promega | E1910 | |
| GST/His pull-down | 谷胱甘肽Sepharose 4B | Abclonal | AS044 |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PCGF6敲除细胞系建立 | gRNA序列、电转条件、嘌呤霉素筛选浓度和单细胞分选方法 阅读提示：Methods中Generation of knockout cell lines小节及Supplementary Fig. 1a |
| 神经外胚层分化 | 细胞接种密度、神经诱导培养基成分、SB431542和LDN193189浓度、诱导时间及撤药时间点 阅读提示：Methods中Neuroectoderm differentiation小节 |
| SRE敲除与SOX2回补 | SRE gRNA序列、SRE-KO亚克隆编号、SOX2过表达慢病毒载体及分选方法 阅读提示：Methods中Generation of knockout cell lines和Overexpressing SOX2 and PCGF6 in PCGF6-KO human PSCs小节，以及Fig. 5d、e |
| ChIP-seq和ChIP-qPCR | 抗体用量、交联条件、染色质片段大小、免疫沉淀孵育时间和qPCR引物位置 阅读提示：Methods中ChIP-seq and data analysis小节及Fig. 5b、j |
| MYC敲低 | shMYC序列、慢病毒包装与感染条件、嘌呤霉素筛选浓度 阅读提示：Methods中MYC knockdown小节及Fig. 5k |