衰老细胞条件培养基的制备与表征
验证衰老细胞模型并获取SASP因子来源的条件培养基。
通过H-RasV12表达、连续传代或X射线照射诱导IMR-90或TIG-3细胞衰老，检测衰老标志物，收集条件培养基。
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衰老细胞来源的肝细胞生长因子减弱细胞竞争诱导的致癌细胞顶端清除
Hepatocyte growth factor derived from senescent cells attenuates cell competition-induced apical elimination of oncogenic cells.
实验完整度
高包含体外细胞竞争模型、小鼠肝脏和肠道体内模型、类器官及机制验证（HGF/c-Met通路、EMT）。
主要模型
MDCK-pTR GFP-RasV12细胞与MDCK细胞共培养的细胞竞争模型 衰老IMR-90或TIG-3成纤维细胞条件培养基处理模型 高脂饮食喂养的C57BL/6小鼠肝脏HTVi诱导N-RasV12表达模型 LSL-RasV12-IRES-eGFP;villin-Cre-ERT2小鼠肠道细胞竞争模型及类器官
重点核对
细胞竞争实验中MDCK与MDCK-pTR GFP-RasV12细胞按50:1混合，接种于I型胶原凝胶，四环素诱导16小时后量化顶端挤出/基底突出。 衰老IMR-90细胞条件培养基处理3天，或HGF（20 ng/ml）处理3天，或克唑替尼（100 nM）处理1小时。 高脂饮食喂养3个月，HTVi注射30 μg DNA（含27 μg目标质粒和3 μg pCMV(CAT)T7-SB100），克唑替尼50 mg/kg口服三次。 肠道细胞竞争模型小鼠给予他莫昔芬2 mg腹腔注射诱导RasV12，ARV825 5 mg/kg腹腔注射5天（共2周）。
摘要
细胞衰老和细胞竞争是在癌症发展初期限制携带致癌突变细胞的重要肿瘤抑制机制。然而，细胞衰老与细胞竞争之间的联系尚不清楚。在体内衰老过程中积累的衰老细胞通过衰老相关分泌表型（SASP）的发展促进年龄相关癌症。在此，我们报道肝细胞生长因子（HGF），一种SASP因子，在细胞竞争实验中抑制Ras突变细胞的顶端挤出并促进其基底突出。此外，高脂饮食诱导的细胞衰老促进携带致癌突变细胞的存活，而克唑替尼，一种HGF信号抑制剂，促使突变细胞从小鼠肝脏和肠道中清除。我们的研究提供证据表明细胞衰老通过HGF信号抑制细胞竞争介导的致癌细胞清除，提示其可能导致衰老过程中的癌症发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞衰老如何影响细胞竞争对致癌Ras突变细胞的清除？
- 核心机制
- 衰老细胞分泌的HGF通过激活c-Met信号诱导RasV12细胞发生EMT样改变，从而抑制细胞竞争介导的顶端挤出并促进基底突出。
- 主要证据
- 体外细胞竞争实验显示衰老条件培养基或HGF抑制RasV12细胞顶端挤出；体内高脂饮食小鼠中克唑替尼或ARV825促进突变细胞清除；基因表达分析显示EMT相关基因改变。
- 研究意义
- 揭示了细胞衰老与细胞竞争两个肿瘤抑制机制之间的串扰，提示靶向HGF/c-Met通路或衰老细胞可能为衰老个体癌症预防提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞竞争实验检测衰老条件培养基对RasV12细胞挤出的影响
探究衰老细胞分泌因子对细胞竞争的影响。
MDCK和MDCK-pTR GFP-RasV12细胞分别用衰老或对照条件培养基处理3天，混合后接种于胶原凝胶，四环素诱导RasV12表达，16小时后量化顶端挤出和基底突出。
鉴定SASP因子HGF及其对细胞竞争的作用
确定衰老条件培养基中抑制细胞竞争的关键因子。
使用细胞因子阵列筛选衰老条件培养基中上调的因子，并逐一测试候选重组蛋白；用HGF中和抗体或siRNA敲低HGF验证。
HGF诱导RasV12细胞EMT样改变的机制研究
探究HGF抑制细胞竞争的分子机制。
对衰老条件培养基或HGF处理的RasV12 MDCK细胞进行微阵列分析和RT-qPCR，检测EMT标志物表达和形态变化。
克唑替尼在体外逆转衰老条件培养基的抑制作用
验证HGF/c-Met信号抑制能否恢复细胞竞争。
在细胞竞争实验前用克唑替尼处理RasV12细胞，检测其对HGF或衰老条件培养基抑制作用的逆转。
高脂饮食小鼠肝脏细胞竞争模型及克唑替尼干预
在体内验证衰老对细胞竞争的影响及HGF信号抑制的作用。
高脂饮食喂养小鼠3个月，通过HTVi注射N-RasV12质粒诱导肝细胞表达，给予克唑替尼，通过生物发光成像和免疫荧光评估RasV12细胞清除。
肠道细胞竞争模型及ARV825干预
在另一体内模型中验证衰老细胞对细胞竞争的影响。
使用LSL-RasV12-IRES-eGFP;villin-Cre-ERT2小鼠，他莫昔芬诱导RasV12表达，高脂饮食喂养，ARV825清除衰老细胞，免疫荧光量化顶端挤出。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Nacalai Tesque | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| X射线照射 | CP-160 X射线机 | Faxitron X-ray Corporation | -- |
| 细胞竞争实验 | 重组人白细胞介素-6 | PEPRO TECH | 200-06 |
| 重组人白细胞介素-8 | PEPRO TECH | 200-08M | |
| 重组人GDF-15/IMC-1 | PEPRO TECH | 120-28C | |
| 重组人MCP-1 (CCL2) | PEPRO TECH | 300-04 | |
| 重组人肝细胞生长因子 | PEPRO TECH | 100-39 | |
| 重组人转化生长因子-β1 | PEPRO TECH | 100-21 | |
| 重组人CD105蛋白 | Abcam | ab54338 | |
| 重组人BSG蛋白(P01) | Abnova | H00000682-P01 | |
| 重组人DPP4蛋白(P01) | Abnova | H00001803-P01 | |
| 重组人五聚素3/TSG-14 | R&D Systems | 1826-TS | |
| uPAR蛋白(84-95)乱序肽 | Anygen | C180084 | |
| Alexa Fluor 568鬼笔环肽 | Invitrogen | A12380 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Life Technologies | -- | |
| LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | mirVana™ miRNA分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PrimeScript RT预混液 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | RR820A | |
| StepOne Plus PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blotting | BCA蛋白测定试剂 | Pierce | -- |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 抗Ras抗体 | Oncogene Research Products | OP41 | |
| 抗lamin-B1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1 | |
| 抗磷酸化Met (Tyr1234/1235) (D26)抗体 | Cell Signaling Technology | 3077 | |
| ECL抗小鼠IgG，辣根过氧化物酶标记全抗体 | GE Healthcare | NA931V | |
| ECL抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记全抗体 | GE Healthcare | NA934V | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FUSION成像系统 | Vilber-Lourmat | -- | |
| ELISA | Quantikine ELISA人HGF免疫测定试剂盒 | R&D Systems | DHG00B |
| 细胞因子阵列 | Proteome Profiler Array人XL细胞因子阵列试剂盒 | R&D Systems | ARY022B |
| 免疫荧光 | 抗γ-H2AX抗体 | Millipore | 05-636 |
| 抗磷酸化(Ser/Thr) ATM/ATR底物抗体 | Cell Signaling Technology | 2851 | |
| 抗α-SMA抗体 | Sigma | A5228 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| 抗结蛋白抗体 | Sigma | D1033 | |
| 抗HGF抗体 | R&D Systems | AF-294-NA | |
| 抗CXCL10抗体 | R&D Systems | AF-466-NA | |
| 抗53BP1抗体 | Santa Cruz | sc-22760 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Alexa Fluor 594驴抗山羊抗体 | Thermo Fisher Scientific | A11058 | |
| 细胞衰老检测试剂盒 | Dojindo | SG03 | |
| 重组抗Ki-67抗体(SP6) | Abcam | ab16667 | |
| 微阵列分析 | Quick Amp标记试剂盒 | Agilent | -- |
| Agilent表达微阵列 | Agilent | -- | |
| 质粒构建 | pSBbi-Hyg质粒 | Addgene | 60524 |
| pIRES2-EGFP质粒 | Invitrogen | -- | |
| HTVi | pCMV(CAT)T7-SB100质粒 | Addgene | 34879 |
| TransIT-EE流体动力学递送溶液 | Mirus | -- | |
| 体内药物处理 | 克唑替尼 | LKT laboratories | C6935 |
| 体内成像 | IVIS成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 免疫组织化学 | Tissue-Tek OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| 抗NRAS抗体 | Proteintech | 10724-1-AP | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Invitrogen | 131900 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| 山羊抗鸡IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Life Technologies | P36961 | |
| 体内细胞竞争模型 | 他莫昔芬 | Sigma | C8267 |
| ARV825 | MedChemExpress | HY-16954 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504-044 | |
| 重组人表皮生长因子 | Peprotech | 315-09 | |
| 重组小鼠Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| 他莫昔芬 | Sigma | T5648 | |
| RNA原位杂交 | nestin多克隆抗体 | Proteintech | 19483-1-AP |
| RNAscope探针Mm-Hgf-1 | Advanced Cell Diagnostics | 435381 | |
| RNAscope 2.5 HD试剂盒-RED | Advanced Cell Diagnostics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞竞争实验 | MDCK与MDCK-pTR GFP-RasV12细胞比例50:1；四环素诱导时间16小时；条件培养基处理时间3天；胶原凝胶包被。 阅读提示：Methods中Cell competition assay小节及Fig. 1e, f图注。 |
| 衰老诱导与条件培养基制备 | X射线照射剂量10 Gy；细胞接种密度2500 cells cm−2；照射后不传代培养10天；条件培养基收集前孵育3天。 阅读提示：Methods中Cell culture小节及Fig. 1a–e图注。 |
| HGF处理与敲低 | 重组HGF浓度20 ng/ml处理3天；siRNA浓度25 nM转染两次间隔2天。 阅读提示：Methods中Reagent and recombinant proteins及RNA interference小节，Fig. 2e, f图注。 |
| 克唑替尼体外处理 | 克唑替尼浓度100 nM，细胞竞争实验前1小时处理。 阅读提示：Methods中Cell competition assay小节及Supplementary Fig. 6。 |
| 高脂饮食小鼠肝脏HTVi模型 | HFD喂养3个月；HTVi注射总DNA 30 μg（含27 μg目标质粒和3 μg pCMV(CAT)T7-SB100）；克唑替尼50 mg/kg口服三次；生物发光成像第1天和第6天。 阅读提示：Methods中HTVi and immunohistochemistry小节及Fig. 4a图注。 |
| 肠道细胞竞争模型与ARV825处理 | 他莫昔芬2 mg腹腔注射；ARV825 5 mg/kg腹腔注射5天（共2周）；HFD喂养3个月。 阅读提示：Methods中In vivo and ex vivo cell competition model小节及Fig. 5a图注。 |