EZH2通过整合素β1-FAK激活参与TGFβ信号通路促进乳腺癌骨转移

EZH2 engages TGFβ signaling to promote breast cancer bone metastasis via integrin β1-FAK activation.

作者信息Lin Zhang, Jingkun Qu, Yutao Qi, Yimin Duan, Yu-Wen Huang, Zhifen Zhou, Ping Li, Jun Yao, Beibei Huang, Shuxing Zhang, Dihua Yu

PMID35538070

期刊Nat Commun

发布时间2022-05-10

DOI10.1038/s41467-022-30105-0

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实验完整度

高

包含体外细胞模型、三重共培养、小鼠心内/胫骨内注射模型、患者数据集分析及机制验证（IP、ChIP、质谱、突变体）

主要模型

MDA-MB-231及其骨趋向性231-1566亚系 4T1小鼠乳腺癌细胞 RAW264.7前破骨细胞与MC3T3成骨细胞三重共培养裸鼠心内和胫骨内注射骨转移模型

重点核对

EZH2敲低/敲除对骨转移发生率和生存期的影响（心内注射1×10^5细胞） GSK126和EPZ-6438对骨转移的抑制效果（剂量和给药途径） FAK抑制剂VS-6063对骨转移生长的抑制（50 mg/kg，每日两次，口服灌胃） TGFβRI Y182磷酸化增强TGFβRI-TGFβRII结合的验证（Y182F/Y182D突变体） EZH2作为RNA Pol II辅因子调控ITGB1转录的ChIP-qPCR验证

摘要

晚期乳腺癌患者中50–70%会发生骨转移，亟需有效疗法。组蛋白甲基转移酶EZH2（zeste同源增强子2）的表达与乳腺癌转移相关，但其在骨转移中的功能尚未充分探索。本文报道EZH2通过调控转化生长因子β（TGFβ）信号通路促进乳腺癌溶骨性转移。EZH2诱导癌细胞增殖和破骨细胞成熟，而敲低EZH2则降低体内骨转移发生率和生长。机制上，EZH2转录上调ITGB1（编码整合素β1），整合素β1激活黏着斑激酶（FAK），FAK磷酸化TGFβI型受体（TGFβRI）第182位酪氨酸，增强其与TGFβII型受体（TGFβRII）的结合，从而激活TGFβ信号通路。临床可用的FAK抑制剂而非EZH2甲基转移酶抑制剂能有效抑制体内乳腺癌骨转移。总体而言，我们发现EZH2-整合素β1-FAK轴与TGFβ信号通路协同促进乳腺癌骨转移。

EZH2对骨转移的体内功能验证

验证EZH2在乳腺癌骨转移中的作用及EZH2甲基转移酶抑制剂的影响

将EZH2敲低或敲除的MDA-MB-231/231-1566细胞心内或胫骨内注射入裸鼠，观察骨转移发生率和生存期，并用GSK126或EPZ-6438处理

EZH2对细胞迁移侵袭和增殖的影响

评估EZH2在体外对癌细胞迁移、侵袭和增殖的作用及甲基转移酶依赖性

Transwell迁移和侵袭实验检测EZH2敲除/敲低及回补野生型或H689A突变体后的细胞迁移侵袭能力，MTT检测增殖

三重共培养模拟骨转移微环境

验证EZH2对肿瘤细胞增殖和破骨细胞成熟的影响

GFP标记的乳腺癌细胞与RAW264.7前破骨细胞和MC3T3成骨细胞共培养，TGFβ处理，流式检测肿瘤细胞数量，TRAP染色检测成熟破骨细胞

EZH2调控TGFβ/Smad2和FAK信号通路

探究EZH2对TGFβ下游信号和FAK活化的影响

Western blot检测pS465/467-Smad2、pY397-FAK等，RPPA分析蛋白表达谱，FAK抑制剂或敲低验证FAK对Smad2磷酸化的作用

FAK磷酸化TGFβRI及Y182位点鉴定

验证FAK对TGFβRI的酪氨酸磷酸化及Y182位点的功能

免疫共沉淀检测FAK与TGFβRI结合、TGFβRI与TGFβRII结合，质谱鉴定磷酸化位点，构建Y182F/Y182D突变体验证结合亲和力

EZH2转录调控ITGB1的机制验证

验证EZH2作为RNA Pol II辅因子调控ITGB1转录

ChIP-seq和ChIP-qPCR检测EZH2和RNA Pol II在ITGB1启动子的结合，qRT-PCR检测ITGB1 mRNA，双荧光素酶报告基因检测启动子活性

FAK抑制剂对骨转移的体内治疗效果

评估FAK抑制剂VS-6063对EZH2诱导骨转移生长的抑制效果

胫骨内注射MDA-MB-231细胞，分别给予vehicle、GSK126或VS-6063，BLI监测骨转移生长，IHC检测pS465/467-Smad2和PTHLH

实验环节	名称	品牌	货号
Western blot	抗EZH2抗体	Cell Signaling Technology	5246
抗pS465/467-Smad2抗体	Cell Signaling Technology	3108
抗pY397-FAK抗体	Cell Signaling Technology	3283
抗FAK抗体	Cell Signaling Technology	3285
抗TGFβRI抗体	Abcam	ab31013
抗TGFβRII抗体	Abcam	ab184948
抗整合素β1抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-8978
抗RNA聚合酶II抗体	Novus Biologicals	NB200-598
抗磷酸酪氨酸抗体	BD Biosciences	610000
抗β-肌动蛋白抗体	Sigma-Aldrich	A5441
药物处理	GSK126	Cayman Chemical	15415
VS-6063	Cayman Chemical	17737
VS-4718	Cayman Chemical	17668
EPZ-6438	TargetMol	1463254-99-8
细胞培养	TGFβ1	BioVision	4342-5
TRAP染色	白细胞酸性磷酸酶试剂盒	Sigma-Aldrich	387A
质粒转染	LipoD293 DNA体外转染试剂	SignaGen	SL100468
siRNA转染	pepMute小干扰RNA转染试剂	SignaGen	SL100566
质粒转染	Lipofectamine 3000转染试剂盒	Invitrogen	L3000-008
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668030
慢病毒感染	hexadimethrine bromide（聚凝胺）	InvivoGen	ant-hg-1
细胞筛选	潮霉素	InvivoGen	ant-hg-1
嘌呤霉素	InvivoGen	ant-pr-1
实时定量PCR	SYBR FAST通用qPCR预混液	Kapa Biosystems	KK4602
逆转录	iScript cDNA合成试剂盒	Bio-Rad	1708891
RNA提取	TRIzol试剂	Thermo Fisher Scientific	15596026
荧光素酶报告基因检测	双荧光素酶报告基因检测试剂盒	Promega	E1910
细胞增殖检测	MTT	Thermo Fisher Scientific	M6496
免疫沉淀	蛋白G偶联琼脂糖珠	Sigma	1124323300

实验环节

名称

品牌

货号

Western blot

抗EZH2抗体

Cell Signaling Technology

5246

抗pS465/467-Smad2抗体

Cell Signaling Technology

3108

抗pY397-FAK抗体

Cell Signaling Technology

3283

抗FAK抗体

Cell Signaling Technology

3285

抗TGFβRI抗体

Abcam

ab31013

抗TGFβRII抗体

Abcam

ab184948

抗整合素β1抗体

Santa Cruz Biotechnology

sc-8978

抗RNA聚合酶II抗体

Novus Biologicals

NB200-598

抗磷酸酪氨酸抗体

BD Biosciences

610000

抗β-肌动蛋白抗体

Sigma-Aldrich

A5441

药物处理

GSK126

Cayman Chemical

15415

VS-6063

Cayman Chemical

17737

VS-4718

Cayman Chemical

17668

EPZ-6438

TargetMol

1463254-99-8

细胞培养

TGFβ1

BioVision

4342-5

TRAP染色

白细胞酸性磷酸酶试剂盒

Sigma-Aldrich

387A

质粒转染

LipoD293 DNA体外转染试剂

SignaGen

SL100468

siRNA转染

pepMute小干扰RNA转染试剂

SignaGen

SL100566

质粒转染

Lipofectamine 3000转染试剂盒

Invitrogen

L3000-008

Lipofectamine 2000

Life Technologies

11668030

慢病毒感染

hexadimethrine bromide（聚凝胺）

InvivoGen

ant-hg-1

细胞筛选

潮霉素

InvivoGen

ant-hg-1

嘌呤霉素

InvivoGen

ant-pr-1

实时定量PCR

SYBR FAST通用qPCR预混液

Kapa Biosystems

KK4602

逆转录

iScript cDNA合成试剂盒

Bio-Rad

1708891

RNA提取

TRIzol试剂

Thermo Fisher Scientific

15596026

荧光素酶报告基因检测

双荧光素酶报告基因检测试剂盒

Promega

E1910

细胞增殖检测

MTT

Thermo Fisher Scientific

M6496

免疫沉淀

蛋白G偶联琼脂糖珠

Sigma

1124323300

环节	核对要点
动物骨转移模型	细胞注射数量（心内1×10^5，胫骨内2×10^5）、小鼠品系（雌性athymic NCr nu/nu，8周龄）、给药剂量和途径阅读提示：Methods中Animal experiments部分及对应Figure legends
三重共培养	细胞接种密度（RAW264.7 3×10^4/孔，MC3T3 3×10^4/孔，肿瘤细胞3×10^4/孔或4T1 500/孔）、TGFβ浓度（5 ng/mL）、共培养时间（6天）阅读提示：Methods中Triple co-culture assay and TRAP staining部分及Fig. 2 legend
FAK抑制剂体内治疗	VS-6063剂量（50 mg/kg，每日两次，口服灌胃）、给药起始时间（注射后第18天）阅读提示：Methods中Animal experiments部分及Fig. 6 legend
TGFβRI Y182磷酸化验证	Y182F/Y182D突变体构建、免疫共沉淀条件、TGFβ处理浓度和时间（5 ng/mL，2小时）阅读提示：Methods中Site-specific mutation和Western blotting and immunoprecipitation部分及Fig. 4 legend
ChIP-qPCR检测EZH2和RNA Pol II结合	引物序列（P1-P5）、抗体用量、细胞固定条件阅读提示：Methods中Chromatin IP-quantitative PCR部分及Fig. 5 legend

环节

核对要点

动物骨转移模型

细胞注射数量（心内1×10^5，胫骨内2×10^5）、小鼠品系（雌性athymic NCr nu/nu，8周龄）、给药剂量和途径

阅读提示：Methods中Animal experiments部分及对应Figure legends

三重共培养

细胞接种密度（RAW264.7 3×10^4/孔，MC3T3 3×10^4/孔，肿瘤细胞3×10^4/孔或4T1 500/孔）、TGFβ浓度（5 ng/mL）、共培养时间（6天）

阅读提示：Methods中Triple co-culture assay and TRAP staining部分及Fig. 2 legend

FAK抑制剂体内治疗

VS-6063剂量（50 mg/kg，每日两次，口服灌胃）、给药起始时间（注射后第18天）

阅读提示：Methods中Animal experiments部分及Fig. 6 legend

TGFβRI Y182磷酸化验证

Y182F/Y182D突变体构建、免疫共沉淀条件、TGFβ处理浓度和时间（5 ng/mL，2小时）

阅读提示：Methods中Site-specific mutation和Western blotting and immunoprecipitation部分及Fig. 4 legend

ChIP-qPCR检测EZH2和RNA Pol II结合

引物序列（P1-P5）、抗体用量、细胞固定条件

阅读提示：Methods中Chromatin IP-quantitative PCR部分及Fig. 5 legend

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