VP35与AKIP1相互作用的鉴定
验证EBOV VP35是否与宿主AKIP1结合并确定结合区域。
酵母双杂交筛选人肝cDNA文库，免疫共沉淀，免疫印迹，PLA，免疫荧光共定位。
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埃博拉病毒VP35通过AKIP1关联劫持PKA-CREB1通路以促进复制和发病机制
Ebola virus VP35 hijacks the PKA-CREB1 pathway for replication and pathogenesis by AKIP1 association.
实验完整度
高包含体外细胞模型、病毒样颗粒、活病毒感染的细胞、AKIP1敲除小鼠模型和转录组学数据，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HepG2细胞（野生型和AKIP1敲除） HEK293细胞 HUVECs C57BL/6N小鼠（野生型和Akip1−/−） 活EBOV（Mayinga株）感染 EBOV trVLPs（转录复制 competent 病毒样颗粒）
重点核对
活EBOV（Mayinga株）感染HepG2细胞的MOI为10，感染后72小时检测 AKIP1敲除HepG2细胞（两个独立克隆KO1和KO2）的验证 PKA抑制剂H89（10 μM）和CREB1抑制剂666-15（1 μM）的处理浓度 Ad-VP35或Ad-null经尾静脉注射小鼠的剂量（2×10^9 PFU或3×10^9 PFU）和次数 Luc-trVLPs复制通过荧光素酶活性、vRNA水平和免疫染色检测
摘要
埃博拉病毒（EBOV）是最致命的病毒之一，是致死性埃博拉病毒病（EVD）的病因。病毒复制和EBOV相关出血的潜在机制尚未完全阐明。在此，我们显示EBOV VP35，一种病毒RNA依赖性RNA聚合酶的辅因子，结合人A激酶相互作用蛋白（AKIP1），从而激活蛋白激酶A（PKA）和PKA下游转录因子CREB1。在EBOV感染期间，CREB1被招募到病毒包涵体（VIBs）中的EBOV核糖核蛋白复合物中，并被用于病毒复制。AKIP1耗竭或PKA-CREB1抑制显著损害EBOV复制。同时，包括THBD和SERPINB2在内的几个凝血相关基因的转录被VP35依赖性CREB1激活大幅上调，这可能促进EBOV相关出血。EBOV VP35劫持宿主PKA-CREB1信号轴以促进病毒复制和发病机制的发现为抗EVD提供了新的潜在治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EBOV VP35如何通过宿主因子促进病毒复制和致病性，特别是与凝血紊乱相关的机制。
- 核心机制
- EBOV VP35与AKIP1结合，激活PKA并促进CREB1磷酸化；活化的CREB1被招募到病毒包涵体中增强病毒复制，同时促进凝血相关基因THBD和SERPINB2的转录，可能导致出血。
- 主要证据
- 通过酵母双杂交、免疫共沉淀、PLA和共定位证实VP35与AKIP1相互作用；AKIP1敲除或PKA/CREB1抑制显著降低trVLPs和活EBOV复制；微阵列和qRT-PCR显示VP35上调THBD和SERPINB2；Ad-VP35感染小鼠表现出凝血异常和死亡率增加，可被666-15 rescue。
- 研究意义
- 揭示了EBOV VP35劫持宿主PKA-CREB1信号轴促进病毒复制和凝血紊乱的新机制，为抗EVD治疗提供了潜在新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
VP35通过AKIP1激活PKA
验证VP35是否通过AKIP1激活PKA并促进CREB1磷酸化。
PKA活性测定，cAMP浓度测定，免疫印迹检测PKA底物磷酸化和CREB1 S133磷酸化，免疫荧光检测PRKACA核转位。
CREB1被招募到病毒包涵体
验证活化的CREB1是否被招募到VIBs中并参与病毒复制复合物。
免疫荧光共定位，蔗糖密度梯度离心，免疫共沉淀，RNA免疫沉淀。
AKIP1-PKA-CREB1轴对病毒复制的影响
评估AKIP1、PKA和CREB1对EBOV复制的影响。
Luc-trVLPs复制检测（荧光素酶活性），vRNA定量，活EBOV滴度测定（TCID50）。
VP35对凝血相关基因转录的调控
验证VP35是否通过CREB1上调THBD和SERPINB2转录。
微阵列转录组分析，qRT-PCR，免疫印迹，免疫组化。
VP35诱导凝血紊乱的体内验证
在体内验证VP35通过AKIP1-PKA-CREB1通路导致凝血紊乱。
小鼠尾出血时间测定，凝血分析（PT、FIB），生存曲线，免疫组化检测TM。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
转录组分析
体内凝血功能评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | GIBCO | -- |
| 最低必需培养基 | GIBCO | -- | |
| 非必需氨基酸溶液 | GIBCO | -- | |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| EGM-2培养基 | Lonza | -- | |
| 药物处理 | 佛司可林 | Selleck | -- |
| H89 | Selleck | -- | |
| 666-15 | MCE | -- | |
| T-705 | Selleck | -- | |
| 芦可替尼 | Selleck | -- | |
| 脂多糖 | Sigma | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8测定 | Dojindo | -- |
| 台盼蓝染色 | Invitrogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| 免疫沉淀 | 抗Flag抗体 | Sigma | F2426 |
| 抗Myc抗体 | Sigma | E6654 | |
| 抗CREB1抗体 | Cell Signaling Technology | 9197 | |
| 免疫球蛋白G | Sigma | A2909或A0919 | |
| 免疫印迹 | HRP标记抗Myc抗体 | Sigma | SAB4200742 |
| HRP标记抗Flag抗体 | Sigma | A8592 | |
| HRP标记抗GFP抗体 | Santa Cruz | sc-8334 | |
| HRP标记抗β-actin抗体 | Sigma | A3854 | |
| 抗磷酸化(Ser/Thr) PKA底物抗体 | Cell Signaling Technology | 9621 | |
| 抗VP35抗体 | Creative Diagnostics | CABT-B292或CABT-B1099 | |
| 抗L抗体 | Creative Diagnostics | CABT-B1095 | |
| 抗NP抗体 | Sino Biological | 40443-MM07 | |
| 抗AKIP1抗体 | Abcam | ab135996 | |
| 抗pCREB1-S133抗体 | Abcam | ab32096 | |
| 抗血栓调节蛋白抗体 | Abcam | ab109189 | |
| 抗SerpinB2抗体 | Abcam | ab137588 | |
| 抗PRKACA抗体 | BD Biosciences | 610980 | |
| 抗IFN-β抗体 | Proteintech | 69013-1-Ig | |
| 抗VASP抗体 | Cell Signaling Technology | 3132 | |
| 抗pVASP-S157抗体 | Cell Signaling Technology | 3111 | |
| 抗pPRKACA-T197抗体 | Cell Signaling Technology | 5661 | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗Akt-T308抗体 | Cell Signaling Technology | 9275 | |
| 抗Akt-S473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| PageRuler蛋白质分子量标准 | Thermo | -- | |
| RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 病毒RNA迷你试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| RT-qPCR | ReverTra Ace qPCR RT master mix with gDNA remover | Toyobo | FSQ-301 |
| SYBR Green实时PCR Master Mix | Toyobo | QPK-201 | |
| QuantStudio 6 Flex多色实时PCR检测系统 | ABI | -- | |
| 原位PLA | Duolink原位邻近连接 assay | Sigma | DUO82007 |
| 兔抗AKIP1抗体 | Thermo | PA5-66385 | |
| 兔抗L抗体 | Creative Diagnostics | CABT-B1095 | |
| 鼠抗VP35抗体 | Creative Diagnostics | CABT-B292 | |
| 鼠抗PRKACA抗体 | BD Biosciences | 610980 | |
| 免疫荧光 | 抗NP抗体 | Sino Biological | 40443-T62 |
| 荧光素酶报告基因测定 | CRE报告质粒 | Promega | -- |
| 海肾荧光素酶质粒 | -- | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| TD-20/20发光检测仪 | Promega | -- | |
| GloMax 20/20发光检测仪 | Promega | -- | |
| PKA激酶活性测定 | PKA激酶活性试剂盒 | Enzo | -- |
| cAMP测定 | 直接cAMP酶免疫测定试剂盒 | Enzo | -- |
| trVLPs测定 | Renilla-Glo荧光素酶测定试剂盒 | Promega | E2710 |
| 被动裂解缓冲液 | Promega | -- | |
| RNA免疫沉淀 | ChIP-IT高灵敏度试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| 活病毒RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 微阵列 | SurePrint G3人基因表达8x60k v2微阵列 | Agilent | -- |
| GeneChip扫描仪G2565CA | Agilent | -- | |
| 凝血分析 | 自动血凝分析仪 | Rayto | RAC-030 |
| 蛋白纯化 | Ni NTA beads 6FF | -- | -- |
| 小鼠实验 | 表达VP35的重组腺病毒 | Beijing BAC Biological Technologies | -- |
| 空载体腺病毒 | Beijing BAC Biological Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VP35与AKIP1相互作用验证 | VP35突变体F239A/K319A/R322A的构建；免疫共沉淀中抗体用量和裂解液成分；RNase处理条件（RNase A 0.4 U/ml和RNase T1 16.6 U/ml，37°C 15分钟）。 阅读提示：Methods中'Immunoprecipitation and immunoblot analysis'和'Vectors and viruses'部分；Figure 1及其图注。 |
| PKA-CREB1通路激活检测 | Ad-VP35感染MOI=10；FSK处理浓度25 μM和时间45分钟或4小时；H89浓度10 μM；CREB1磷酸化检测抗体稀释比例1:1000。 阅读提示：Methods中'PKA kinase activity assay'和'Immunoblot analysis'部分；Figure 3和Figure 4图注。 |
| 病毒复制检测（trVLPs和活EBOV） | trVLPs转染质粒用量（p4cis-vRNA-RLuc 250 ng，pCAGGS-T7 250 ng，pCAGGS-NP 125 ng，pCAGGS-VP35 125 ng，pCAGGS-VP30 75 ng，pCAGGS-L 1000 ng）；活EBOV感染MOI（0.1或1）和感染时间（72或96小时）；抑制剂浓度（H89 10 μM，666-15 1 μM，T-705 50 μM）。 阅读提示：Methods中'EBOV trVLPs assay'和'EBOV infection assay'部分；Figure 6图注。 |
| CREB1招募到病毒包涵体检测 | EBOV minigenome（p0）转染48小时；666-15（1 μM）或H89（10 μM）处理；蔗糖密度梯度离心条件（25-60%蔗糖，137,000×g 2.5小时）；RNA-IP中抗体用量（CREB1抗体1:25）。 阅读提示：Methods中'Sucrose density gradient centrifugation'和'RNA immunoprecipitation (RNA-IP) assays'部分；Figure 5图注。 |
| 小鼠体内凝血实验 | Ad-VP35剂量（2×10^9或3×10^9 PFU）和注射次数（两次，间隔24小时）；666-15剂量（2 mg/kg）和给药途径（腹腔注射）；LPS剂量（5 mg/kg）和攻击时间；小鼠周龄（10周）和性别（雌性）。 阅读提示：Methods中'Tail bleeding time'和'Coagulation analysis'部分；Figure 7图注。 |