临床样本采集与多组学数据生成
获取中国ccRCC患者的蛋白质基因组学图谱并确保样本质量。
收集232对肿瘤及癌旁组织，进行蛋白质组学分析和全外显子测序，并进行病理质量控制确认肿瘤纯度和癌旁无肿瘤细胞。
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中国人群透明细胞肾细胞癌的蛋白质基因组学分析
A proteogenomic analysis of clear cell renal cell carcinoma in a Chinese population.
实验完整度
高含232对临床样本多组学、三种细胞系体外功能、机制验证及裸鼠移植瘤体内实验
主要模型
232对中国ccRCC患者肿瘤及癌旁组织 ACHN、786-O、769-P、A-498及HEK293T细胞系 Balb/C裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
临床样本：232对肿瘤与癌旁组织，中位随访85个月，肿瘤纯度>90% 细胞系：ACHN和786-O用于NNMT过表达及功能实验，769-P和A-498用于部分验证 营养应激：无血清无葡萄糖培养基培养12小时 基因毒性应激：4 Gy X射线照射 移植瘤：NNMT过表达细胞皮下接种，NAC腹腔注射500 mg/kg隔日一次
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾癌中常见且侵袭性的亚型。在此，我们对232对中国ccRCC患者的肿瘤及癌旁非肿瘤组织进行了全面的蛋白质基因组学分析。与癌旁组织比较，我们发现ccRCC表现出广泛的代谢失调和增强的免疫反应。分子分型将ccRCC肿瘤分为三个亚型（GP1–3），其中最具侵袭性的GP1表现出最强的免疫表型、增加的转移和代谢失衡，将多组学衍生的表型与ccRCC的临床结局联系起来。烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT），一种一碳代谢酶，被鉴定为ccRCC的潜在标志物和GP1的药物靶点。我们证明NNMT诱导DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）的同型半胱氨酸化，增加DNA修复，并促进ccRCC肿瘤生长。本研究为ccRCC的生物学基础提供了见解，并揭示可靶向的代谢脆弱性，有助于预后评估。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 中国ccRCC患者的蛋白质基因组学特征、分子分型及其与临床结局的关联，以及潜在治疗靶点NNMT的作用机制。
- 核心机制
- NNMT过表达导致Hcy积累和蛋白赖氨酸同型半胱氨酸化（K-Hcy）增强，DNA-PKcs的K-Hcy修饰促进DNA-PKcs与KU70/KU80复合物形成，激活DNA-PKcs，增强DNA修复，促进肿瘤生长。
- 主要证据
- 232对ccRCC样本的多组学分析鉴定NNMT高表达与不良预后相关；细胞实验证实NNMT过表达增加Hcy和K-Hcy，减少DNA损伤；移植瘤实验显示NNMT过表达促进肿瘤生长，NAC抑制K-Hcy可延缓生长。
- 研究意义
- 提供了中国ccRCC的蛋白质基因组学图谱，将多组学特征与临床结局联系，并揭示NNMT–K-Hcy–DNA-PKcs轴作为潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异蛋白与通路分析
鉴定ccRCC肿瘤与癌旁组织的蛋白质表达差异及相关通路改变。
对肿瘤和癌旁组织进行蛋白质组学比较，鉴定差异表达蛋白，并进行通路富集分析。
分子分型与临床关联分析
基于蛋白质组数据对ccRCC进行分子分型并关联临床特征和预后。
使用共识聚类将肿瘤分为GP1、GP2、GP3三个亚型，比较亚型间生存差异、基因组改变和通路特征。
NNMT功能验证
验证NNMT对ccRCC细胞增殖和DNA损伤的影响。
在ACHN、786-O等细胞中过表达或敲低NNMT，检测细胞增殖、γ-H2AX水平、彗星实验及代谢物变化。
NNMT–Hcy–DNA-PKcs机制研究
阐明NNMT通过Hcy积累和K-Hcy修饰激活DNA-PKcs的分子机制。
检测NNMT过表达后SAM、SAH、Hcy和K-Hcy水平，通过免疫共沉淀、体外激酶实验和突变体实验验证DNA-PKcs的K-Hcy修饰及其对DNA-PKcs活性的影响。
体内移植瘤验证
验证NNMT过表达对肿瘤生长的影响及NAC干预效果。
将NNMT过表达及对照细胞皮下接种裸鼠，观察肿瘤生长，部分小鼠接受IR处理或NAC腹腔注射。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| DNA定量 | Qubit 3.0荧光定量仪 | Life Technologies | -- |
| DNA片段化 | Covaris M220系统 | Covaris | -- |
| 文库构建 | Accel-NGS 2 S HYB DNA文库构建试剂盒 | Swift Biosciences | 23096 |
| 外显子富集 | xGen外显子研究面板v1.0 | IDT | 1056115 |
| xGen Lockdown试剂 | IDT | 1072281 | |
| 文库纯化 | Dynabeads M-270链霉亲和素磁珠 | Thermo | 65306 |
| 文库扩增 | HotStart ReadyMix预混液 | KAPA | KK2612 |
| 文库纯化 | SPRISELECT纯化试剂 | Beckman | B23319 |
| DNA质检 | Bioanalyzer高灵敏度DNA分析试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 |
| 测序 | Nextseq CN500测序平台 | Illumina | -- |
| 蛋白质提取 | Bradford蛋白测定 | TaKaRa | T9310A |
| 蛋白质组学分析 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM） | HyClone | -- |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 质粒构建 | ClonExpress MultiS一步克隆试剂盒 | Vazyme | C113-02 |
| 定点突变 | MutanBEST定点突变试剂盒 | TaKaRa | -- |
| Western blot | DNA-PKcs抗体 | Cell Signaling Technology | 38168 |
| 磷酸化Ser2056 DNA-PKcs抗体 | Cell Signaling Technology | 68716 | |
| H2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 7631 | |
| γ-H2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| p53抗体 | Cell Signaling Technology | 9282 | |
| 磷酸化Ser15 p53抗体 | Cell Signaling Technology | 9284 | |
| KU70抗体 | Cell Signaling Technology | 4103 | |
| KU80抗体 | Cell Signaling Technology | 2753 | |
| NNMT抗体 | Abcam | ab58743 | |
| Actin抗体 | Genscript | A00702 | |
| 免疫组化 | Envision检测试剂盒 | Dako | -- |
| 代谢物定量 | Axis同型半胱氨酸酶免疫分析试剂盒 | Axis-Shield | -- |
| SAM与SAH ELISA组合试剂盒 | Cell Biolabs | -- | |
| DNA-PK激酶实验 | ADP-GloTM + DNA-PK激酶系统 | Promega | 4107 |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| 彗星实验 | 彗星实验试剂盒 | Trevigen | -- |
| 动物实验 | N-乙酰半胱氨酸（NAC） | -- | -- |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Amresco | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本采集与病理质控 | 肿瘤纯度>90%；癌旁组织距肿瘤>2 cm且无肿瘤细胞；样本冻存时间与条件 阅读提示：Methods中Clinical sample collection小节及Supplementary Fig. 1a |
| 蛋白质组学与全外显子测序 | WES平均覆盖度120.5×（肿瘤）和68.72×（癌旁）；蛋白质组学QC样本平均相关系数0.95；肽段分离梯度 阅读提示：Methods中DNA extraction and WES、LC-MS/MS小节及Supplementary Fig. 1g |
| 细胞功能实验 | 细胞系来源与代次；营养应激时间12 h；X射线剂量4 Gy；CCK-8实验每组5重复；彗星实验每组30细胞来自5次独立重复 阅读提示：Methods中Cell culture、Cell proliferation assay、Comet assay小节及Fig. 6图注 |
| NNMT机制实验 | NNMT过表达或敲低效率验证；SAH/Hcy补充浓度；MAT或SAHH敲低效率；DNA-PKcs激酶实验条件（30°C 30 min） 阅读提示：Methods中Plasmid construction、RNA interference、DNA-PKcs in vitro kinase assay小节及Fig. 6、Fig. 7图注 |
| 移植瘤实验 | 小鼠品系、周龄和性别；细胞接种数量；IR处理剂量；NAC给药剂量500 mg/kg及频率隔日一次；肿瘤体积测量终点 阅读提示：Methods中In Vivo Xenograft studies小节及Fig. 7p, q图注 |