构建pegRNA/spegRNA/apegRNA表达载体
建立可表达不同pegRNA变体的载体系统，用于后续编辑效率比较。
以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin为模板扩增pegRNA-scaffold片段，克隆入BsaI和EcoRI线性化载体，构建pGL3-U6-pegRNA-PGK-puromycin；通过定点突变或引入C/G配对构建apegRNA表达载体；通过退火寡核苷酸连接构建spacer和RTT变体。
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通过在pegRNA中引入同义突变或稳定其结构实现高效先导编辑
Highly efficient prime editing by introducing same-sense mutations in pegRNA or stabilizing its structure.
实验完整度
高在293FT、U2OS、HeLa三种人细胞系中验证编辑效率，并检测脱靶、副产物及剪接影响，包含功能与机制验证。
主要模型
293FT细胞系 U2OS细胞系 HeLa细胞系 ACE2-S19A、HBB-E7V、PGM3-L111S工程细胞系
重点核对
转染后24 h加入4 μg/ml嘌呤霉素，再培养48 h后提取基因组DNA测序 PE3系统中pegRNA表达质粒0.9 μg、pegRNA质粒0.3 μg、nick-sgRNA质粒0.1 μg共转染 每组实验三次独立重复，编辑频率以均值±标准差表示 以未转染细胞（NT）作为阴性对照 使用Illumina HiSeq X10或NovaSeq 6000进行深度测序，要求目标位点至少1,000条独立reads
摘要
先导编辑器（PE）由Cas9切口酶和工程化逆转录酶组合而成，可介导活细胞中全部十二种碱基替换以及小插入或缺失，但其效率仍然较低。在这里，我们通过在pegRNA的逆转录模板适当位置引入同义突变，开发了spegRNA，可将PE的碱基编辑效率提高至多4,976倍（平均353倍）。我们还通过改变pegRNA二级结构开发了apegRNA，可将PE的 indel 编辑效率提高至多10.6倍（平均2.77倍）。spegRNA和apegRNA可以组合以进一步提高编辑效率。当spegRNA和apegRNA用于PE3和PE5系统时，sPE3、aPE3、sPE5和aPE5系统的效率均显著增强。本研究开发的策略在某些先前不可编辑的位点实现了高效先导编辑。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何提高先导编辑（PE）在活细胞中生成碱基替换和小插入/缺失的编辑效率。
- 核心机制
- 在pegRNA的逆转录模板适当位置引入同义突变（spegRNA）或改变pegRNA小发夹结构以稳定其二级结构（apegRNA），分别提高碱基编辑和indel编辑效率；两种策略可组合。
- 主要证据
- 在293FT、U2OS和HeLa细胞中，spegRNA使碱基编辑效率平均提高353倍（最高4,976倍），apegRNA使indel编辑效率平均提高2.77倍（最高10.6倍）；spegRNA和apegRNA分别与PE3、PE5组合均显著增强编辑效率，且未显著增加脱靶编辑。
- 研究意义
- 本研究开发的策略可在先前不可编辑的位点实现高效先导编辑，且sPE和aPE系统不需要额外蛋白或RNA组分，有利于未来体内递送和治疗应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在293FT细胞中转染并比较编辑效率
验证spegRNA和apegRNA相对于常规pegRNA是否能提高碱基编辑或indel编辑效率。
将293FT细胞接种于24孔板，共转染PE2表达质粒、pegRNA（spegRNA或apegRNA）表达质粒和nick-sgRNA表达质粒，嘌呤霉素筛选后提取基因组DNA，PCR扩增目标位点并进行深度测序，计算编辑频率。
检测脱靶编辑、副产物及剪接影响
评估spegRNA和apegRNA策略的特异性及潜在副作用。
通过深度测序检测目标位点的非预期indel频率、不完全产物和副产物频率，以及预测的pegRNA依赖性脱靶位点的编辑频率；通过逆转录PCR检测编辑基因（EMX1和ACTG1）的剪接模式。
在U2OS和HeLa细胞中验证编辑效率
验证spegRNA和apegRNA策略在其他人类细胞系中的适用性。
在U2OS和HeLa细胞中分别比较spegRNA与常规pegRNA的碱基编辑效率，以及apegRNA与常规pegRNA的indel编辑效率。
在PE3和PE5系统中组合验证spegRNA和apegRNA
测试spegRNA和apegRNA与PE3、PE5系统组合是否能进一步增强编辑效率。
在293FT细胞中分别使用PE3、PE5、sPE3（PE3+spegRNA）、sPE5（PE5+spegRNA）、aPE5（PE5+apegRNA）等系统，针对多个靶点检测碱基编辑或indel编辑频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | NovoRec® plus一步PCR克隆试剂盒 | Novoprotein | NR005 |
| 细胞培养与转染 | DMEM培养基 | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10566 |
| 胎牛血清 | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| LIPOFECTAMINE LTX转染试剂 | Life, Invitrogen | -- | |
| LIPOFECTAMINE plus转染增强剂 | Life, Invitrogen | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 |
| 基因组DNA提取 | QuickExtractTM DNA提取液 | Epicentre | QE09050 |
| 目标序列PCR扩增 | Phanta® Max超保真DNA聚合酶 | Vazyme | P505 |
| RNA提取 | TransZol® Up Plus RNA提取试剂盒 | TransGen | -- |
| 逆转录 | cDNA合成预混液 | TransGen | -- |
| 深度测序 | Illumina HiSeq X10测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 文库定量 | Qubit高灵敏度DNA定量试剂盒 | Invitrogen | -- |
| DNA文库构建 | NEBNext Ultra II FS DNA文库构建试剂盒（Illumina） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞转染与编辑效率检测 | 细胞类型（293FT、U2OS、HeLa）、接种密度（1×10^5/孔，24孔板）、转染试剂用量（LIPOFECTAMINE LTX 2.6 μl + plus 1.3 μl）、质粒用量（PE2 0.9 μg、pegRNA 0.3 μg、nick-sgRNA 0.1 μg）、嘌呤霉素浓度（4 μg/ml）及筛选时间（转染后24 h加入，继续48 h） 阅读提示：Methods中“Cell culture and transfection”小节 |
| pegRNA设计 | spegRNA同义突变引入位置（RTT的1、5、6、2/5、3/6位，以RTT 3'端碱基为1位）、apegRNA-2的小发夹C/G配对改变 阅读提示：Results中“Extra point mutation in RTT improves base editing efficiency”和“Altered pegRNA secondary structure improves indel efficiency”小节，以及Fig. 1g和Supplementary Fig. 11a |
| 编辑频率计算 | 碱基替换频率、indel频率、不完全产物和副产物频率的计算公式；非预期indel统计区域（PAM上游8 nt至下游52 nt，共80 bp）；目标位点至少1,000条独立reads 阅读提示：Methods中“Base substitution frequency calculation”“Indel frequency calculation at on-target sites”“Incomplete products and byproducts frequencies calculation”小节 |
| 脱靶分析 | pegRNA依赖性脱靶位点预测参数（最多5个错配，Cas-OFFinder）及脱靶indel频率计算区域 阅读提示：Methods中“Predication of pegRNA-dependent OT site”和“Indel frequency calculation at pegRNA-dependent OT site”小节 |
| 统计分析与重复 | 三次独立实验、均值±标准差、Wilcoxon单尾符号秩检验、样本量未预先设定、实验未随机化 阅读提示：Methods中“Statistics and reproducibility”小节及图注 |