构建铜绿假单胞菌伤口感染模型并评估ExoT对炎症反应的影响
验证ExoT是否在伤口中抑制IL-1β和IL-18产生及白细胞浸润。
用PA103、PAK野生型及ExoT、ExoS、ExoU缺失突变株感染C57BL/6小鼠全层切除伤口，24小时后检测IL-1β、IL-18、白细胞浸润和MPO阳性中性粒细胞。
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CrkII/Abl磷酸化级联对NLRC4炎症小体活性至关重要，并被铜绿假单胞菌ExoT阻断
CrkII/Abl phosphorylation cascade is critical for NLRC4 inflammasome activity and is blocked by Pseudomonas aeruginosa ExoT.
实验完整度
高包含BMDMs体外模型、基因敲除小鼠伤口感染模型、临床分离株验证，并有siRNA/抑制剂/回补等功能与机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠全层切除伤口感染模型 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 铜绿假单胞菌PA103和PAK菌株及其T3SS等基因突变株 铜绿假单胞菌伤口临床分离株WI-14和WI-16
重点核对
伤口感染剂量：每伤口1000个细菌（10 μL生理盐水） BMDMs感染复数（M.O.I）：10–20，感染时间1–2小时 Imatinib体内给药：100 mg/kg腹腔注射，于伤口和感染前48、24、2小时给药 PKCδ抑制剂Rottlerin预处理浓度5 µM，处理90分钟 Abl抑制剂Imatinib体外预处理浓度30 µM，处理90分钟
摘要
III型分泌系统（T3SS）是一种高度保守的毒力结构，在包括铜绿假单胞菌在内的许多革兰阴性病原菌的致病过程中发挥关键作用。Exotoxin T（ExoT）是所有表达T3SS的铜绿假单胞菌菌株中唯一表达的T3SS效应蛋白。本研究表明，T3SS识别引发涉及Abl/PKCδ/NLRC4的快速磷酸化级联反应，导致NLRC4炎症小体激活，最终产生限制铜绿假单胞菌伤口感染中的炎症反应。我们进一步表明，ExoT是铜绿假单胞菌的主要抗炎剂，它通过靶向CrkII阻断Abl/PKCδ/NLRC4的磷酸化级联反应，我们进一步证明CrkII对于响应T3SS和铜绿假单胞菌感染的Abl反式激活和NLRC4炎症小体激活至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铜绿假单胞菌T3SS及ExoT如何影响伤口宿主炎症反应，以及ExoT抑制NLRC4炎症小体的分子机制是什么。
- 核心机制
- T3SS识别触发CrkII/Abl→PKCδ→NLRC4磷酸化级联，导致caspase-1激活和IL-1β/IL-18产生；ExoT通过其ADPRT结构域破坏CrkII/Abl相互作用，阻断该磷酸化级联。
- 主要证据
- 在BMDMs和C57BL/6小鼠伤口感染模型中，ExoT缺失菌株引起更高的Abl/PKCδ/NLRC4磷酸化、caspase-1激活、IL-1β/IL-18产生和白细胞浸润；siRNA或抑制剂敲低Abl/PKCδ/CrkII，以及NLRC4/S533A回补实验，均减弱NLRC4炎症小体激活。
- 研究意义
- 揭示了ExoT作为铜绿假单胞菌主要抗炎剂通过靶向CrkII阻断NLRC4炎症小体激活的机制，有助于理解该病原体在伤口中的免疫逃逸策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在BMDMs中鉴定识别铜绿假单胞菌的主要炎症小体亚型
确定哪种caspase-1依赖性炎症小体亚型介导对铜绿假单胞菌的识别。
用野生型或ExoT缺失铜绿假单胞菌感染BMDMs，通过ELISA检测IL-1β/IL-18，Western blot检测caspase-1激活，免疫荧光检测NLRC4/ASC斑点；并使用caspase-1、caspase-11及NLRP1b、NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin敲除BMDMs。
验证NLRC4炎症小体在体内控制铜绿假单胞菌感染的作用
评估NLRC4炎症小体在伤口中对细菌清除的作用。
用PA103及其T3SS突变株感染C57BL/6、ASC−/−、Caspase-1−/−和NLRC4−/−小鼠伤口，24小时后通过系列稀释涂板测定细菌载量。
验证PKCδ对NLRC4磷酸化及炎症小体激活的必要性
确定PKCδ是否介导NLRC4 Ser533磷酸化并激活NLRC4炎症小体。
在NLRC4−/− BMDMs中回补野生型NLRC4或NLRC4/S533A突变体，或用PKCδ siRNA或Rottlerin处理BMDMs，感染铜绿假单胞菌后检测NLRC4磷酸化、caspase-1激活和IL-1β/IL-18产生。
确定ExoT通过ADPRT结构域抑制NLRC4炎症小体
区分ExoT的GAP和ADPRT结构域在抑制NLRC4炎症小体中的作用。
用表达ExoT或ADPRT/GAP结构域突变体的铜绿假单胞菌感染BMDMs，检测PKCδ/NLRC4磷酸化、caspase-1激活、IL-1β/IL-18产生和caspase-1/ASC斑点。
验证CrkII/Abl在PKCδ和NLRC4磷酸化上游的作用
确定CrkII和Abl是否参与NLRC4炎症小体激活的磷酸化级联。
用Crk siRNA或Abl siRNA敲低BMDMs，或用Abl抑制剂Imatinib处理，或使用Ablflox/floxLysM Cre+ BMDMs，感染铜绿假单胞菌后检测PKCδ/NLRC4磷酸化、caspase-1激活和IL-1β/IL-18产生；Co-IP检测CrkII、Abl、PKCδ、NLRC4相互作用。
在体内验证Abl激酶对NLRC4炎症小体激活和细菌清除的必要性
评估Abl激酶在伤口中对NLRC4炎症小体激活和铜绿假单胞菌感染控制的作用。
C57BL/6小鼠腹腔注射Imatinib或PBS，然后伤口感染PA103 ΔUΔT株，24小时后检测Abl/PKCδ/NLRC4磷酸化、caspase-1激活、IL-1β/IL-18、白细胞浸润、MPO和细菌载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 超纯LPS | Invivogen | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | -- | |
| Rottlerin | -- | -- | |
| 伊马替尼 | -- | -- | |
| FAK抑制剂1,2,4,5-苯四胺四盐酸盐 | -- | -- | |
| Src抑制剂PP2 | -- | -- | |
| Lck抑制剂TC-S7003 | -- | -- | |
| Fyn抑制剂AZD0530 | -- | -- | |
| Lyn抑制剂Lyn肽抑制剂 | -- | -- | |
| Z-VAD | -- | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | 抗caspase-1 (P20)抗体 | AdipoGen | AG20B0042C100 |
| 抗ASC多克隆抗体(AL177) | AdipoGen | AG25B0006C100 | |
| Crk小鼠单克隆抗体克隆22 | BD | 610035 | |
| NLRC4抗体 | Abcam | ab201792 | |
| NLRC4抗体 | Millipore Sigma | 06-112-5MI | |
| 磷酸化NLRC4 (Ser533)多克隆抗体 | ECM Biosciences | NP5411 | |
| 磷酸化NLRC4 (Ser533)小鼠抗人/鼠克隆4B7B7 | Invitrogen | PIMA531846 | |
| PKCδ多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2058 | |
| 磷酸化PKCδ (Tyr311)抗体 | Cell Signaling Technology | 2055 | |
| 小鼠IL-1β抗体 | R&D systems | AF-401-NA | |
| 小鼠(MOPC-21) mAb IgG1同型对照 | Cell Signaling Technology | 4097 | |
| NLRC4多克隆抗体 | Invitrogen | PA5-72908 | |
| 抗c-Abl (24-11)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23 | |
| 驴抗山羊IgG二抗(HRP) | Novus Biologicals | NBP1-74815 | |
| β-Actin (13E5)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Abcam | ab9535 | |
| 抗ABL1 (磷酸化Y245)抗体 | Abcam | ab193223 | |
| HRP标记抗兔IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7074 S | |
| HRP标记抗小鼠IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| GAPDH兔多克隆抗体 | Proteintech | 1094-I-AP | |
| 免疫共沉淀 | 直接和经典免疫沉淀试剂盒 | Pierce | -- |
| 抗Flag抗体 | Millipore Sigma | F1804 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | AB5450 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG (H+L)二抗Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 |
| 山羊抗兔IgG (H+L)二抗Texas Red | Invitrogen | T-6391 | |
| DAPI核染料 | -- | -- | |
| 免疫组化 | 抗髓过氧化物酶抗体 | Abcam | ab9535 |
| 动物实验 | 伊马替尼 | -- | -- |
| 组织消化 | 胶原酶D | -- | -- |
| 细胞培养 | NLRC4/S533A载体 | Cell Biolabs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠伤口感染模型 | 细菌剂量：每伤口1000个细菌；小鼠品系和年龄：约7周龄C57BL/6；检测时间：感染后24小时；每组小鼠数：N=5–8 阅读提示：Methods中Wounding and wound infection小节及Fig. 1图注 |
| BMDMs感染实验 | M.O.I：10–20；感染时间：1–2小时；LPS预处理：2–6小时；BMDMs来源小鼠品系 阅读提示：Methods中Bone marrow-derived macrophages (BMDMs)小节及Fig. 2–6图注 |
| 抑制剂处理BMDMs | PKCδ抑制剂Rottlerin浓度5 µM，预处理90分钟；Abl抑制剂Imatinib浓度30 µM，预处理90分钟；其他酪氨酸激酶抑制剂浓度及处理时间 阅读提示：Methods中Bone marrow-derived macrophages (BMDMs)小节及Fig. 3、Fig. 6图注 |
| siRNA敲低实验 | Crk siRNA转染48小时；PKCδ siRNA转染48小时；Abl siRNA转染24小时；siRNA终浓度100 nM；感染M.O.I 20，2小时 阅读提示：Methods中Protein depletion by siRNA transfection小节及Fig. 3、Fig. 5、Fig. 6图注 |
| Imatinib体内给药实验 | Imatinib剂量100 mg/kg，腹腔注射；给药时间：伤口和感染前48、24、2小时；细菌剂量：每伤口1000个细菌；检测时间：感染后24小时；每组小鼠数：N=8（部分N=5） 阅读提示：Methods中Wounding and wound infection小节及Fig. 7图注 |
| NLRC4回补实验 | NLRC4−/− BMDMs回补野生型NLRC4或NLRC4/S533A；感染M.O.I 20，2小时；检测指标：caspase-1激活、IL-1β/IL-18 阅读提示：Methods中Nlrc4−/− cells’ reconstitution小节及Fig. 3a–c图注 |
| 免疫荧光检测炎症小体斑点 | BMDMs感染M.O.I 10–20，1小时；固定：4% PFA 20分钟；抗体稀释度；每个重复≥7个随机视野 阅读提示：Methods中Fluorescence microscopy小节及Fig. 2i–j、Fig. 4e–f图注 |