藻株分离与培养
获取海洋Epithemia纯培养物以研究其共生关系。
从Station ALOHA不同深度采集海水，通过系列稀释或单细胞微吸管分离建立培养物，培养于低氮培养基。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
海洋中被忽视且广泛分布的羽纹硅藻-固氮生物共生体
Overlooked and widespread pennate diatom-diazotroph symbioses in the sea.
实验完整度
高包含藻株分离培养、显微成像、系统发育分析、qPCR、固氮速率测定、15N2同化、宏基因组分析等多层级验证。
主要模型
Epithemia pelagica UHM3200等藻株 Epithemia catenata UHM3210等藻株 Station ALOHA海水样品
重点核对
藻株分离自Station ALOHA 25、75、100米深度的海水，培养于低氮培养基 内共生体丢失实验：氮充足培养基（K培养基）中培养四个月，约每两周转移5-10%培养物 固氮速率测定：10 mL培养物，25±0.2 °C，200 μmol photons m−2 s−1，12:12小时光暗周期 15N2同化测定：加入5 mL 15N富集海水，孵育2小时，设置三个重复 qPCR：使用PowerTrack SYBR Green Master Mix，20 µL反应体系，引物浓度500 nM，四个样本重复
摘要
阳光照射的开阔海洋水体中持续的氮耗尽为固氮（diazotrophic）蓝细菌提供了有利的生态位，其中一些与真核藻类共生。所有已知的海洋共生实例都涉及中心硅藻或定鞭藻宿主。我们在此报告发现并表征了两种不同的海洋羽纹硅藻-固氮生物共生体，迄今为止仅在淡水环境中观察到。从亚热带北太平洋反复分离到Rhopalodiaceae硅藻Epithemia pelagica sp. nov.和Epithemia catenata sp. nov.，序列文库分析揭示了其全球分布。这些共生体可能逃过了关注，因为内共生体缺乏荧光光合色素，其nifH基因序列与自由生活的单细胞蓝细菌相似，并且在氮充足培养基中会丢失。海洋Rhopalodiaceae-固氮生物共生体是海洋生境中一个先前被忽视但广泛分布的生物可利用氮来源，并为细胞器进化研究提供了新的、易于培养的模型生物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 海洋中是否存在羽纹硅藻与固氮蓝细菌的共生体，其分布和固氮特性如何？
- 核心机制
- 宿主硅藻为内共生体提供固定碳源，内共生体则固定大气中的氮气，形成互惠共生关系。
- 主要证据
- 从亚热带北太平洋分离到两种Epithemia新种，其内共生体具有nifH基因，缺乏光合色素，在氮充足培养基中丢失；全球序列分析显示广泛分布；固氮速率测定显示独特的昼夜节律。
- 研究意义
- 这些共生体是海洋中广泛分布但被忽视的生物可利用氮来源，并可作为研究细胞器进化的易培养模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
形态学与超微结构观察
表征新种的形态特征并可视化内共生体。
使用光学显微镜、落射荧光显微镜和电子显微镜观察活体、固定和渗透休克处理的细胞，测量细胞和内共生体尺寸。
系统发育分析
确定新种的分类地位及其内共生体的进化关系。
扩增宿主SSU、psbC、rbcL、LSU、cob基因和内共生体SSU、nifH基因，进行贝叶斯和最大似然系统发育分析。
内共生体丢失实验
测试内共生体在氮充足条件下的稳定性。
将培养物在氮充足培养基（K培养基）中连续转移四个月，通过光学显微镜和PCR检测内共生体丢失。
全球分布分析
确定Epithemia共生体在海洋环境中的分布范围。
通过BLAST搜索NCBI nt和SRA数据库中的nifH序列，以及Tara Oceans宏基因组和宏转录组数据，映射100%相同序列的采样位置。
固氮速率测定
量化E. pelagica和E. catenata内共生体的昼夜固氮模式。
使用乙酰还原法和氩诱导氢气产生法连续监测固氮速率，并用15N2同化验证。
环境定量与宏基因组分析
评估Epithemia共生体在自然环境中的丰度和垂直传输。
使用qPCR定量Station ALOHA水样中宿主LSU和内共生体nifH基因拷贝数，并分析4000米深沉降颗粒宏基因组中的序列。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞固定与染色 | SYBR Gold核酸染料 | Invitrogen | S11494 |
| 细胞破碎 | 微量离心管研磨棒 | SP Bel-Art | F19923-0000 |
| DNA提取 | ZymoBIOMICS DNA小量制备试剂盒 | Zymo Research | D4300 |
| PCR扩增 | Expand高保真PCR系统 | Roche | 4743733001 |
| 克隆 | TOPO TA测序克隆试剂盒 | Invitrogen | K457501 |
| 质粒提取 | Zyppy质粒小量制备试剂盒 | Zymo Research | D4019 |
| qPCR | PowerTrack SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A46109 |
| DNA提取 | MasterPure完整DNA和RNA纯化试剂盒 | Epicentre | MC85200 |
| 过滤 | Anotop氧化铝过滤器 | Whatman | WHA68092102 |
| 细胞计数 | Sedgwick-Rafter计数框 | Electron Microscopy Sciences | 68050-52 |
| 显微镜观察 | Nikon Eclipse 90i显微镜 | Nikon | -- |
| 电子显微镜观察 | Hitachi S-4800场发射扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| Hitachi HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| qPCR | Eppendorf Mastercycler epgradient S realplex2实时PCR仪 | Eppendorf | -- |
| 固氮速率测定 | Incu-Shaker台式培养箱 | Benchmark Scientific | -- |
| Prime HD+光源 | Aqua Illumination | -- | |
| 15N2同化分析 | Carlo-Erba EA NC2500元素分析仪与ThermoFinnigan Delta Plus XP同位素比质谱仪联用 | Carlo-Erba; ThermoFinnigan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 藻株分离与培养 | 海水采集深度（25、75、100米）、培养基组成（低氮培养基含2 μM EDTA、50 nM柠檬酸铁铵、7.5 μM磷酸、微量元素、维生素和106 μM Na2SiO3）、培养温度（24°C）、光暗周期（12:12小时）、光照强度（50-100 μmol quanta m−2 s−1） 阅读提示：Methods: Epithemia isolation and culture |
| 内共生体丢失实验 | 氮充足培养基（K培养基）组成（5×10−5 M NH4+，8.82×10−4 M NO3−）、转移频率（约每两周5-10%）、培养时间（四个月） 阅读提示：Results and discussion; Methods: Morphological observations |
| 固氮速率测定 | 培养物体积（10 mL）、温度（25±0.2°C）、光照强度（200 μmol photons m−2 s−1）、光暗周期（12:12小时）、乙酰浓度（1% vol/vol）、流速（13 mL min−1）、15N2同化孵育时间（2小时）、重复数（三个重复） 阅读提示：Methods: Physiology experiments; Fig. 4 legend |
| qPCR | 引物序列（Epel-LSU-F/R, EpSB-nifH-F/R）、反应体积（20 µL）、引物浓度（500 nM）、模板量（2 μL环境DNA，24-76 ng）、循环条件（95°C 2分钟，40循环95°C 5秒，57°C或55°C 30秒）、样本重复数（四个重复）、标准品（gBlocks Gene Fragments，三个重复） 阅读提示：Methods: Quantitative PCR |
| 全球分布分析 | BLAST参数（megablast和dc-megablast，98-100%一致性）、数据库版本（NCBI nt、SRA、Tara Oceans MATOU） 阅读提示：Methods: Analysis of Epithemia endosymbiont nifH sequences in environmental datasets |