建立并校准聚集检测与分选体系
区分含聚集体细胞与弥漫表达细胞，为转录组和筛选提供读出。
利用PulSA方法结合流式细胞术，对表达HTT-134Q-GFP、HTT-17Q-GFP、FUS-WT-YFP、FUS-R521H-YFP或FUS-R518K-YFP的HEK293T细胞进行AGG+与AGG−分选。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
分子伴侣筛选揭示DNAJ亚型在HTT-polyQ与FUS聚集调控中的差异化作用
Differential roles for DNAJ isoforms in HTT-polyQ and FUS aggregation modulation revealed by chaperone screens.
实验完整度
高结合HEK293T细胞聚集筛选、RNA-seq、共免疫沉淀、FRAP及大鼠原代神经元验证
主要模型
HEK293T细胞表达HTT-134Q-GFP或mutFUS-YFP 大鼠原代海马神经元AAV感染表达FUS-R521H-YFP 66种FLAG标记分子伴侣共表达筛选体系
重点核对
PulSA流式分选AGG+与AGG−细胞，聚集调控评分以DsRed对照的95%置信区间判定显著性 DNAJB14-FL与DNAJB14-short对FUS-R521H-YFP聚集的差异保护，FRAP回收率42%对29.5% DNAJB14 HPD突变及ΔDUF缺失体丧失保护，siDNAJB12敲低使DNAJB14-FL保护降低42% 原代神经元中DNAJB14-FL较DNAJB14-short减少约26%含聚集体神经元（p=7.9e−7等）
摘要
蛋白聚集是神经退行性疾病的标志。本研究发现，亨廷顿病相关的HTT-polyQ聚集诱导细胞产生蛋白毒性应激反应，而ALS相关的突变型FUS（mutFUS）聚集则导致蛋白稳态恶化。在进一步探索分子伴侣功能作为病理聚集潜在修饰因子的过程中，我们发现天然存在的分子伴侣亚型对不同聚集类型具有不同效应。我们鉴定出全长（FL）DNAJB14与DNAJB12组成的复合物，该复合物以HSP70依赖的方式显著保护细胞免于mutFUS聚集。然而，它们的天然短亚型不能形成该复合物，并丧失阻止mutFUS聚集的能力。相反，DNAJB12-short减轻HTT-polyQ聚集，而DNAJB12-FL加重HTT-polyQ聚集。DNAJB14-FL表达增加mutFUS聚集体的流动性，并恢复含mutFUS聚集体细胞及原代神经元中恶化的蛋白稳态。我们的结果突出了细胞对病理聚集的不良适应反应，并揭示了DNAJ亚型赋予分子伴侣网络复杂性、进而调控不同聚集类型的一层新机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞是否以相同方式感知不同类型的病理蛋白聚集体，以及HSP70网络中的分子伴侣及其天然亚型如何差异性调控HTT-polyQ与突变FUS聚集。
- 核心机制
- 全长DNAJB14与DNAJB12形成复合物并依赖HSP70结合来保护细胞免于mutFUS聚集；短亚型缺乏J结构域，不能形成复合物或结合HSP70而失去保护作用；DNAJB12-short则减轻HTT-polyQ聚集，而DNAJB12-FL加重其聚集。
- 主要证据
- HEK293T细胞中66种分子伴侣共表达的PulSA流式聚集筛选、RNA-seq转录组分析、共免疫沉淀、免疫荧光、FRAP及大鼠原代海马神经元AAV感染实验共同支持上述结论。
- 研究意义
- 揭示细胞对病理聚集的不良适应反应，以及天然DNAJ亚型通过功能多样化增加分子伴侣网络复杂性，为调控不同聚集类型提供潜在干预方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较不同聚集类型的细胞转录反应
判断细胞对HTT-polyQ与mutFUS聚集的感知和反应是否相同。
对分选所得AGG+与AGG−细胞进行RNA-seq，差异表达分析和聚类，并进行通路富集分析。
分子伴侣共表达筛选HTT-polyQ与mutFUS聚集调控因子
系统鉴定HSP70网络分子伴侣对不同聚集类型的功能影响。
将66种FLAG标记分子伴侣分别与HTT-134Q-GFP或FUS-R521H-YFP共表达，以DsRed为对照，计算聚集调控评分。
验证候选伴侣的剂量依赖性与亚型差异
确认候选伴侣对mutFUS聚集的保护具有剂量依赖性，并比较天然亚型功能差异。
以不同FUS DNA与伴侣DNA比例共转染，检测DNAJB14-FL、DNAJB14-short及其他候选对FUS-R521H-YFP和多种FUS突变体聚集的影响。
解析DNAJB14–DNAJB12–HSP70复合物与结构域功能
确定保护作用依赖的分子相互作用和结构域。
通过共免疫沉淀、免疫荧光共定位、HPD突变体与ΔDUF缺失体、siDNAJB12敲低，检测DNAJB14与DNAJB12、HSP70及FUS的相互作用及DJANGO结构形成。
评估聚集体流动性与蛋白稳态恢复
判断DNAJB14-FL是否改变mutFUS聚集体性质并恢复蛋白稳态。
对共表达FUS-R521H-YFP与DNAJB14-FL或-short的细胞进行FRAP分析，并进行第二个RNA-seq实验及热休克反应报告基因检测。
在原代神经元中验证聚集保护与蛋白稳态恢复
检验HEK293T细胞筛选所得候选在原代神经元中的功能相关性。
大鼠原代海马神经元感染AAV2-PHP.B病毒表达FUS-WT-YFP或FUS-R521H-YFP，并共感染DNAJB14-FL或-short，进行活细胞共聚焦成像和qPCR。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 克隆与质粒构建 | Quikchange 2定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 210518 |
| 细胞培养与转染 | PEI转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 流式分析与分选 | BD FACSAria III分选仪 | BD | -- |
| Chaperone overexpression ELISA | 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 |
| 抗FLAG抗体 | abcam | ab1238 | |
| Co-immunoprecipitation | EZview Red抗FLAG M2亲和凝胶珠 | Sigma-Aldrich | F2426 |
| Western blot | 抗HSC70/HSP70抗体 | Enzo Life Sciences | N27F34 |
| 抗RFP抗体 | abcam | ab34771 | |
| 免疫荧光染色 | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| AlexaFluor 647驴抗小鼠抗体 | Jackson | -- | |
| Co-immunoprecipitation of FUS | Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher | 10001D |
| 抗GFP抗体 | MBL | 598 | |
| Heat shock-responsive promoter assay | Gibson组装预混液 | NEB | E2611 |
| qPCR in HEK293T cells | 快速RNA微量提取试剂盒 | Zymo | R1504 |
| MMLV逆转录酶 | Promega | M170A | |
| siRNA knockdown | RNAiMAX脂质体转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| siDNAJB12 | Dharmacon | 020585-01-0005 | |
| siControl | Dharmacon | 001810-10-05 | |
| 原代神经元培养 | 多聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P7886-50MGP |
| B27添加剂 | -- | -- | |
| Glutamax | Invitrogen | -- | |
| 血清补充剂 | BD Biosciences | 355006 | |
| 阿糖胞苷 | Sigma | C6645 | |
| 原代神经元RNA提取 | 总RNA微量纯化试剂盒 | NORGEN | 35300 |
| 原代神经元qPCR | HPRT引物 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞转染与聚集检测 | HEK293T细胞接种密度、HTT或FUS DNA与伴侣DNA用量、转染后48 h检测时间点、DsRed对照重复数 阅读提示：Methods的Cell culture and transfection及PulSA method小节 |
| PulSA流式聚集评分 | AGG+门控定义、DAPI 5 µM排除非活细胞、95%置信区间计算方式（以DsRed重复间变异计±2*STD） 阅读提示：Methods的PulSA method小节及Fig. 2、Fig. 3图注 |
| RNA-seq与分选 | 分选时间限制12 min、CHX 100 µg/ml、表达基因TPM阈值、DESeq2 FDR阈值 阅读提示：Methods的RNA-seq and data analyses小节 |
| DNAJB14结构域与互作验证 | HPD第136位突变、ΔDUF与Δshort缺失范围、siRNA 15 nM、共免疫沉淀所用抗体与磁珠 阅读提示：Methods的Cloning and plasmid preparation、Co-immunoprecipitation、Small interfering RNA小节及Fig. 4图注 |
| FRAP分析 | DNAJB14-FL组156个与-short组150个聚集体、光漂白参数、成像时长280 s以上 阅读提示：Methods的FRAP analysis小节及Fig. 5图注 |
| 原代神经元验证 | P0大鼠海马神经元每孔150 K、感染第5天、感染后6天成像、Ara-C 4 µM、DNAJB14-FL与-short滴度匹配、分析神经元数量 阅读提示：Methods的Neuronal cultures and infections及Neurons image analysis小节及Fig. 7图注 |