人脑琥珀酰化组与蛋白质组定量
鉴定AD患者脑组织中琥珀酰化修饰和蛋白质丰度的变化。
对两批各5例AD和5例对照的脑组织（Broca区）进行琥珀酰化肽段富集和label-free定量，同时用TMT10-plex进行蛋白质组定量。
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阿尔茨海默病中线粒体蛋白、APP和tau的琥珀酰化改变
Altered succinylation of mitochondrial proteins, APP and tau in Alzheimer's disease.
实验完整度
高包含AD患者脑组织琥珀酰化组/蛋白质组、HEK293T细胞线粒体损伤模型、体外肽段生化实验、NMR及多种转基因小鼠模型，并有功能验证
主要模型
AD患者及健康对照者脑组织（Broca区，BM-44/45） HEK293T细胞系 Tg19959转基因AD小鼠模型 TgP301S转基因tauopathy小鼠模型
重点核对
脑组织样本：AD患者与对照各10例，分两批各5对进行琥珀酰化组和蛋白质组分析 HEK293T细胞处理：rotenone 100 nM或5 μM处理20分钟（免疫荧光实验为100 nM处理60分钟） Tg19959和TgP301S小鼠年龄：4月龄和10月龄，每组n=4 体外α-切割实验：合成Aβ6–29肽段（C-和S-），rhADAM10 0.1 μg/μL，37 °C孵育24小时 tau聚集实验：肽段10 μM，heparin 2.5 μM，25 °C，ThS荧光
摘要
脑葡萄糖代谢异常以及称为斑块和缠结的异常蛋白沉积物的积累是阿尔茨海默病（AD）的神经病理学标志，但它们与疾病发病机制以及彼此之间的关系仍不清楚。在这里，我们表明琥珀酰化，一种与代谢相关的翻译后蛋白修饰（PTM），提供了异常代谢与AD病理之间的潜在联系。我们对AD患者和健康对照者的大脑进行了赖氨酸琥珀酰化组和蛋白质组的定量分析。在AD中，多种线粒体蛋白的琥珀酰化下降，而少数胞质蛋白的琥珀酰化增加。最大的增加发生在淀粉样前体蛋白（APP）和微管相关tau的关键位点。我们表明，在体外，APP的琥珀酰化破坏了其正常的蛋白水解加工，从而促进Aβ积累和斑块形成，而tau的琥珀酰化促进其聚集为缠结并损害微管组装。在AD转基因小鼠模型中，升高的琥珀酰化与可溶性和不溶性APP衍生物及tau相关。这些发现表明，一种与代谢相关的PTM可能与AD相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 琥珀酰化这种代谢相关翻译后修饰是否与阿尔茨海默病的代谢缺陷及APP/tau病理相关。
- 核心机制
- 线粒体功能受损导致线粒体蛋白琥珀酰化下降，同时琥珀酰转移酶释放至胞质，使APP K612和tau K311等位点琥珀酰化增加；APP琥珀酰化抑制α-切割促进Aβ生成和寡聚，tau琥珀酰化促进其聚集并削弱微管结合。
- 主要证据
- AD患者脑琥珀酰化组/蛋白质组显示线粒体蛋白琥珀酰化降低而APP和tau特定位点琥珀酰化升高；HEK293T细胞线粒体损伤模型显示琥珀酰化重分布；体外肽段实验证明琥珀酰化抑制ADAM10切割并增强Aβ寡聚；tau肽段实验显示琥珀酰化促进聚集并抑制微管组装；转基因小鼠免疫荧光显示琥珀酰化与病理早期平行。
- 研究意义
- 提示代谢相关的琥珀酰化可能连接AD的代谢减退与蛋白病变，为AD及相关病理提供潜在分子诊断标志和治疗靶点方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
亚细胞定位与基序分析
确定琥珀酰化蛋白的亚细胞分布及琥珀酰化位点序列特征。
对鉴定到的琥珀酰化蛋白进行亚细胞定位分析（Cytoscape/stringAPP），并用Motif-X和IceLogo分析琥珀酰化肽段序列基序。
线粒体功能损伤细胞模型
验证线粒体功能受损对琥珀酰化分布及蛋白释放的影响。
用rotenone处理HEK293T细胞，分离线粒体和胞质组分，免疫沉淀和Western blot检测琥珀酰化及PDHC/KGDHC亚基分布；免疫荧光观察DLST和COX-IV定位。
APP琥珀酰化功能验证
验证APP K612琥珀酰化对α-切割和Aβ聚集的影响。
合成Aβ6–29肽段（C-和S-，K16琥珀酰化），与rhADAM10孵育后LC-MS/MS定量切割；Aβ42在succinyl-CoA存在下聚集，用ThT荧光、Western blot和电镜检测寡聚和纤维化。
tau琥珀酰化功能验证
验证tau K311琥珀酰化对tau聚集和微管组装的影响。
合成PHF6、S-PHF6、PHF6*、A-PHF6*肽段进行heparin诱导聚集（ThS荧光和电镜）；重组K19进行体外琥珀酰化，检测微管组装（光散射）和NMR（HSQC、STD）分析tau-tubulin相互作用。
转基因小鼠模型验证
在体内验证琥珀酰化与Aβ/tau病理的空间和时间关联。
对4月龄和10月龄Tg19959和TgP301S小鼠脑切片进行免疫荧光，检测琥珀酰化与Aβ寡聚体/斑块、tau寡聚体/磷酸化tau/神经原纤维缠结的共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 琥珀酰化肽段富集 | PTMScan琥珀酰赖氨酸基序试剂盒 | Cell Signaling Technology | 13764 |
| 蛋白质组标记 | TMT10-plex质量标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质酶解 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | 抗DLST抗体 | Cell Signaling Technology | 11954 |
| 抗COX-IV抗体 | Cell Signaling Technology | 11967 | |
| Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A21202 | |
| Alexa Fluor 568驴抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A10042 | |
| Western blot | 泛抗琥珀酰赖氨酸抗体 | PTM Biolabs | PTM-401 |
| 抗β肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| COX-IV（3E11）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4850 | |
| 抗KGDHC E1k | Rockland | -- | |
| 抗KGDHC E2k | Rockland | -- | |
| 抗KGDHC E3（硫辛酰胺脱氢酶抗体） | Rockland | 200-4160 S | |
| β-肌动蛋白（13E5）兔抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| s680RD山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| 800CW山羊抗小鼠IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | |
| 免疫荧光 | 抗MAP2抗体 | Millipore | AB15452 |
| 抗小鼠β-淀粉样蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 15126 S | |
| 抗磷酸化tau AT8 | Thermo Fisher Scientific | MN1020 | |
| Cy3亲和纯化驴抗兔IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| 647亲和纯化驴抗鸡IgY（IgG）（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | |
| α-切割实验 | 重组人ADAM10 | R&D Systems | -- |
| Aβ42聚集实验 | β淀粉样蛋白（1-42）聚集试剂盒 | rPeptide | A-1170-2 |
| Western blot | 抗Aβ寡聚体特异性抗体NU-2 | Klein's lab | -- |
| 抗β淀粉样蛋白抗体6E10 | BioLegend | 803001 | |
| SDS-PAGE | Tricine SDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | LC1676 |
| Tricine SDS电泳缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | LC1675 | |
| 微管组装实验 | 微管蛋白 | Cytoskeleton | T240-B |
| NMR | Bruker AVANCE 600 MHz波谱仪 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人脑琥珀酰化组与蛋白质组 | 样本来源（NIH Neurobiobank和Mount Sinai School of Medicine）、AD与对照各10例、分两批各5对、脑区Broca区（BM-44/45）、质谱数据PXD015124 阅读提示：Methods 'Human brain tissue samples'和'Quantitative proteomics and succinylome'，Supplementary Data 1 |
| HEK293T细胞线粒体损伤模型 | 细胞系HEK293T（ATCC CtRL-3216）、rotenone浓度（100 nM或5 μM）和处理时间（20分钟或60分钟）、线粒体/胞质分离方法 阅读提示：Methods 'Cell culture'、'Preparation of the cytosolic and mitochondrial fractions'和'Immunocytochemistry, image acquisition, and image analysis' |
| APP琥珀酰化功能实验 | Aβ6–29肽段浓度（1 mM）、rhADAM10浓度（0.1 μg/μL）、孵育时间（24小时）、Aβ42浓度（80 μM）、succinyl-CoA浓度（3 mM） 阅读提示：Methods 'α-cleavage assay'和'Aβ42 aggregation assay'，Fig. 5e–g |
| tau琥珀酰化功能实验 | tau肽段浓度（10 μM）、heparin浓度（2.5 μM）、ThS浓度（100 μM）、K19浓度（60 μM）、tubulin浓度（32 μM） 阅读提示：Methods 'Tau peptide self-aggregation assay'和'Microtubule assembly assay'，Fig. 7 |
| 转基因小鼠免疫荧光 | 小鼠品系（Tg19959和TgP301S）、年龄（4月龄和10月龄）、每组n=4、抗体列表和稀释比例、定量方法 阅读提示：Methods 'Animals'、'Immunofluorescence'和'Image analysis'，Supplementary Figs. 3和4 |