计算建模预测BCL-xL上E2可及赖氨酸带状区域
预测BCL-xL表面哪些赖氨酸可被E2催化位点接近以进行泛素化。
构建CRLVHL/DT2216/BCL-xL/UbcH5B-Ub/RBX1复合物模型，进行正态模式分析，预测E2催化位点运动区域覆盖BCL-xL上特定带状区域。
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开发具有改进抗白血病活性的BCL-xL和BCL-2双降解剂
Development of a BCL-xL and BCL-2 dual degrader with improved anti-leukemic activity.
实验完整度
高包含计算建模、细胞系降解实验、突变体分析、三元复合物检测、机制验证及体内外功能验证（如血小板毒性）
主要模型
HEK293T细胞系 Hela细胞系 Kasumi-1急性髓系白血病细胞系 人血小板
重点核对
BCL-xL/2降解通过免疫印迹检测，使用HEK293T和Hela细胞，处理16小时，设置4个浓度 三元复合物形成通过AlphaLISA和NanoBRET检测，使用HEK293T细胞 泛素化通过co-IP检测，使用HEK293T细胞，MG132预处理10 μM 2小时，753b处理0.1 μM（BCL-xL）或1 μM（BCL-2）5小时 细胞活力通过MTS assay检测，Kasumi-1细胞处理72小时 凋亡通过流式细胞术检测，使用Annexin-V和DAPI染色，Kasumi-1细胞处理24小时
摘要
蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）已成为一种创新的药物开发平台。然而，大多数PROTACs是基于经验生成的，因为PROTAC特异性和活性的许多决定因素仍不清楚。通过对整个NEDD8-VHL Cullin RING E3泛素连接酶（CRLVHL）/PROTAC/BCL-xL/UbcH5B(E2)-Ub/RBX1复合物进行计算建模，我们发现该复合物只能泛素化BCL-xL上特定带状区域内的赖氨酸。利用这种方法指导我们开发一系列ABT263衍生的、招募VHL的PROTACs，我们生成了一种有效的BCL-xL和BCL-2（BCL-xL/2）双降解剂，对BCL-xL/2依赖性白血病细胞具有显著改善的抗肿瘤活性。我们的结果提供了实验证据，表明靶蛋白上赖氨酸的可及性在决定PROTAC诱导蛋白质降解的选择性和效力中起重要作用，这可能作为指导未来PROTAC开发的 concept框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 靶蛋白上赖氨酸的可及性是否决定PROTAC诱导的蛋白质降解选择性和效力，以及能否据此开发更有效的BCL-xL/2双降解剂。
- 核心机制
- PROTAC通过改变三元复合物构象，影响BCL-xL和BCL-2表面赖氨酸对E2催化位点的可及性，从而决定泛素化位点和降解效率；753b可诱导BCL-xL的K87和K20以及BCL-2的K17泛素化。
- 主要证据
- 计算建模预测BCL-xL上存在E2可及赖氨酸带状区域；突变体实验证实只有带状区域内赖氨酸（如K87、K20）介导降解；753b在HEK293T和Kasumi-1细胞中降解BCL-xL/2，DC50分别为6 nM和48 nM，并诱导凋亡。
- 研究意义
- 提供了赖氨酸可及性决定PROTAC选择性和效力的实验证据，为PROTAC开发提供概念框架；753b作为BCL-xL/2双降解剂，对BCL-xL/2依赖性白血病和实体瘤有更广泛应用潜力，且血小板毒性低于ABT263。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
突变体分析验证带状区域赖氨酸对DT2216诱导降解的必要性
验证只有位于预测带状区域内的赖氨酸才能介导DT2216诱导的BCL-xL降解。
构建BCL-xL赖氨酸突变体（K-ko, K157-only, K-ko-G186K, K-ko-R34K, K-ko-R102K, K-ko-R132K等），在293T细胞中转染，DT2216处理，免疫印迹检测Flag-BCL-xL降解。
合成和筛选不同连接子长度的BCL-xL/2 PROTACs
通过改变ABT263上连接子连接位点，寻找能更有效降解BCL-xL和BCL-2的PROTAC。
合成一系列以ABT263为warhead、VHL配体为E3招募端的PROTACs（PPC5-PPC11），在HEK293T细胞中测试BCL-xL/2降解，计算DC50和Dmax。
分离PPC8立体异构体并鉴定753b为活性成分
确定PPC8中哪个立体异构体是主要活性成分。
分离PPC8的两种立体异构体753a和753b，在293T细胞中比较它们降解BCL-xL/2的效力，并比较753b与DT2216的降解效力。
验证753b通过VHL和蛋白酶体依赖机制降解BCL-xL/2
确认753b诱导的降解依赖于泛素-蛋白酶体系统和VHL。
使用ABT263或VHL配体预处理，CRISPR敲除VHL，MLN4924抑制NEDD8激活酶，MG132抑制蛋白酶体，QVD抑制caspase，检测对753b诱导降解的影响；RT-qPCR检测mRNA水平。
鉴定753b诱导泛素化的关键赖氨酸
确定753b诱导BCL-xL和BCL-2泛素化的具体赖氨酸位点。
构建BCL-xL和BCL-2赖氨酸突变体，在293T细胞中转染，753b处理，免疫印迹检测降解；co-IP检测泛素化。
评估753b对Kasumi-1白血病细胞的抗肿瘤活性
比较753b与DT2216、ABT199、ABT263对BCL-xL/2依赖性白血病细胞的杀伤效力。
在Kasumi-1细胞中检测BCL-xL/2降解，细胞活力（MTS assay），凋亡（流式细胞术），并测试QVD对凋亡的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12430054 |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 22400–089 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Boston Bio Products | BP-115DG |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | PPC1010 | |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 4× Laemmli SDS样品缓冲液 | Boston Bio Products | BP-110R | |
| Mini-PROTEAN TGX预制4-20% Tris-甘氨酸凝胶 | Bio-Rad | 456–1094 | |
| PVDF印迹膜（0.2微米孔径） | Thermo Fisher Scientific | LC2002 | |
| TBST缓冲液 | Affymetrix | J77500 | |
| 化学发光HRP底物 | MilliporeSigma | WBKLS0500 | |
| BCL-xL抗体 | Cell Signaling Technologies | 2762S | |
| BCL-2抗体 | Cell Signaling Technologies | 2870S | |
| VHL抗体 | Cell Signaling Technologies | 68547S | |
| β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technologies | 2146S | |
| Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technologies | 9662S | |
| cleaved Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technologies | 9664S | |
| Flag标签抗体 | Cell Signaling Technologies | 14793S | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technologies | 3724S | |
| β-肌动蛋白抗体 | MP Biomedicals | 8691001 | |
| 细胞活力检测 | MTS试剂 | Promega | G1111 |
| 血小板活力检测 | 人富血小板血浆 | Zenbio | SER-PRP-SDS |
| 酸性柠檬酸盐缓冲液 | Santa Cruz Biotechnology | sc-214744 | |
| 前列腺素E1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-201223A | |
| 腺苷三磷酸双磷酸酶 | Sigma-Aldrich | A6237 | |
| HEPES缓冲Tyrode溶液 | Boston BioProducts | PY-921WB | |
| 质粒构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | E0554S |
| Lipofectamine 2000试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| RT-qPCR | RNeasy Plus迷你试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| AlphaScreen | His标签BCL-xL蛋白 | Sigma-Aldrich | SRP0187 |
| His标签BCL-2蛋白 | Sigma-Aldrich | SRP0186 | |
| 生物素标记BAD肽 | AnaSpec | -- | |
| 生物素标记BIM肽 | AnaSpec | -- | |
| 6× His受体珠 | PerkinElmer | AL128M | |
| 链霉亲和素供体珠 | PerkinElmer | 6760002 | |
| NanoBRET | HaloTag-VHL质粒 | Promega | CS1679C155 |
| CMV HiBit质粒 | Promega | CS1956B03 | |
| NEBuilder HiFi DNA组装预混液 | NEB | E2621 | |
| Gibco Opti-MEM I减血清培养基，无酚红 | Fisher | 11-058-021 | |
| HaloTag NanoBRET 618配体 | Promega | PRN1662 | |
| NanoBRET Nano-Glo底物 | Promega | N1662 | |
| 蛋白纯化 | 谷胱甘肽Sepharose 4B介质 | Cytiva | 45-000-139 |
| Pierce蛋白浓缩器PES，30K MWCO | ThermoFisher | 88502 | |
| AlphaLISA | Alpha谷胱甘肽供体珠 | PerkinElmer | 6765300 |
| VHL敲除 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 |
| pMD2.G和psPAX2辅助载体 | Addgene | 12259 and 12260 | |
| 泛素化检测 | 抗FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| IP裂解缓冲液 | Thermal Fisher Scientific | 87788 | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FLUOS | Roche | 11828681001 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| QVD（泛caspase抑制剂） | Sigma-Aldrich | SML0063 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BCL-xL/2降解检测 | 细胞系（HEK293T、Hela、Kasumi-1），化合物浓度（4个不同浓度），处理时间（16小时），免疫印迹定量方法 阅读提示：Methods中Immunoblotting部分；Figure legends图2b、3b、3c、7b |
| 三元复合物形成检测 | AlphaLISA实验蛋白浓度（His-BCL-xL 5 nM，His-BCL-2 5 nM，GST-VCB 5 nM），NanoBRET转染质粒量（HaloTag-VHL 1 μg，HiBit-BCL-xL/2 10 ng，LgBit 10 ng），化合物处理时间（6小时） 阅读提示：Methods中AlphaLISA assay和NanoBRET ternary complex formation assay部分；Figure legends图2c-f、3e-h |
| 泛素化检测 | MG132预处理浓度（10 μM）和时间（2小时或1小时），753b处理浓度（0.1 μM for BCL-xL，1 μM for BCL-2）和时间（5小时），转染质粒（Flag-BCL-xL/2突变体，HA-Ub） 阅读提示：Methods中Polyubiquitination assay部分；Figure legend图5c,d |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度（Kasumi-1 50,000-100,000细胞/孔），化合物处理时间（72小时），浓度点数（9个），重复数（3重复），MTS检测方法 阅读提示：Methods中Viability assays部分；Figure legends图7a,c |
| 凋亡检测 | Kasumi-1细胞接种密度（0.2×10^6细胞/孔），化合物处理浓度（0.1或1 μM）和时间（24小时），QVD预处理浓度（10 μM）和时间（2小时），Annexin V-FLUOS和DAPI染色浓度 阅读提示：Methods中Flow cytometry部分；Figure legends图7e,f |