PTEN与核心依赖因子PAX7之间的合成致死关系决定横纹肌肉瘤身份

Synthetic essentiality between PTEN and core dependency factor PAX7 dictates rhabdomyosarcoma identity.

作者信息Casey G Langdon, Katherine E Gadek, Matthew R Garcia, Myron K Evans, Kristin B Reed, Madeline Bush, Jason A Hanna, Catherine J Drummond, Matthew C Maguire, Patrick J Leavey, David Finkelstein, Hongjian Jin, Patrick A Schreiner, Jerold E Rehg, Mark E Hatley

PMID34535684

期刊Nat Commun

发布时间2021-09-17

DOI10.1038/s41467-021-25829-4

来源查看原文

实验完整度

高

包含条件敲除小鼠模型、细胞系/PDX体外功能验证、异种移植体内验证及机制实验（ChIP、荧光素酶报告）

主要模型

aP2-Cre;SmoM2驱动的小鼠FN-RMS模型（ASPWT/ASPcHet/ASPcKO/ASPcKOP7cKO）人FN-RMS细胞系SMS-CTR、RD、Rh18 人FN-RMS患者来源异种移植（PDX）SJRHB015721_X1、SJRHB012405_X1、SJRHB011_Y 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）

重点核对

小鼠基因型分组：ASPWT、ASPcHet、ASPcKO及ASPcKOP7cKO，在P12评估肿瘤质量 Ptenflox/flox与Pax7flox/flox条件性敲除及aP2-Cre;SmoM2/+遗传背景人FN-RMS细胞系及PDX中PAX7、DBX1的shRNA敲低（两种独立shRNA与scramble对照） SCID/Beige小鼠原位（腓肠肌）注射PDX或细胞系后肿瘤体积与质量检测 ChIP-qPCR检测PAX7与DBX1启动子近端位点1结合，以及Dbx1启动子荧光素酶报告基因剂量依赖实验

摘要

PTEN启动子高甲基化在融合阴性横纹肌肉瘤（FN-RMS）中几乎普遍存在，约25%的FN-RMS出现PTEN拷贝数丢失。本研究表明，在FN-RMS小鼠模型中敲除Pten可导致肿瘤分化程度降低，更接近人胚胎型RMS。PTEN丢失激活了PI3K通路，但未增加mTOR活性。在野生型肿瘤中，PTEN表达于细胞核，提示核内PTEN功能丧失可能解释上述表型。Pten敲除肿瘤中参与神经和骨骼肌发育的重要转录因子表达增加，包括Dbx1和Pax7。敲除Pax7可完全挽救Pten丢失的影响。引人注目的是，这些Pten;Pax7双敲除肿瘤不再是FN-RMS，而是表现出类似平滑肌肉瘤的平滑肌分化。这些数据突出了FN-RMS中Pten丢失与PAX7谱系特异性转录输出之间的联系，后者产生了对转录因子PAX7的依赖或合成致死关系，以维持肿瘤身份。

构建Pten条件敲除FN-RMS小鼠模型

验证Pten丢失是否加速并改变FN-RMS肿瘤发生

将aP2-Cre;Ptenflox/+与SmoM2/M2;Ptenflox/+杂交，生成ASPWT、ASPcHet、ASPcKO小鼠，监测肿瘤发生、肿瘤负荷与组织学

评估Pten丢失肿瘤的分化与恶性表型

判断Pten丢失是否使肿瘤分化降低、恶性程度增加

H&E与IHC检测DESMIN、MYOD1、MYOGENIN、Ki67、PTEN；real-time PCR检测肌源性基因；免疫荧光检测MyHC亚型；SCID/Beige皮下移植评估致瘤性

分析PTEN丢失后的信号通路变化

确定Pten丢失对PI3K/AKT/mTOR等信号的影响

RPPA检测350种抗体对应蛋白；免疫印迹检测AKT、S6、4E-BP1、p70S6K磷酸化；rhabdosphere药物敏感性实验（GDC-0941、MK-2206、everolimus、doxorubicin）

鉴定Pten丢失诱导的转录程序及DBX1功能

寻找介导Pten丢失表型的关键转录因子并在人FN-RMS中验证其功能

微阵列/RNA-seq比较ASPWT与ASPcKO肿瘤；real-time PCR验证差异基因；在人FN-RMS细胞系与PDX中shRNA敲低DBX1，检测细胞活力与体内肿瘤生长

验证PAX7对DBX1的转录调控

确定Pten丢失如何上调Dbx1及PAX7是否为直接转录调控因子

Ptenflox MEF腺病毒Cre感染；Dbx1启动子荧光素酶报告基因实验；PAX7过表达与敲低实验；ChIP-qPCR检测PAX7与DBX1启动子结合

验证人FN-RMS对PAX7的依赖

确认PAX7在已建立的人FN-RMS细胞和PDX中为依赖因子

在人FN-RMS细胞系（SMS-CTR、RD、Rh18）及PDX来源细胞中shRNA敲低PAX7，检测细胞活力、增殖及SCID/Beige小鼠原位肿瘤生长

遗传学验证Pten与Pax7的合成致死关系及肿瘤身份转变

确定Pax7缺失能否挽救Pten丢失表型并改变肿瘤命运

构建ASPcKOP7cKO小鼠；组织学、IHC（DESMIN、MYOD1、MYOG、SMA、CALDESMON）、电镜及流式分选后RNA-seq分析

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养基	HyClone	SH32043
胎牛血清	Hyclone	--
抗生素/抗真菌剂	Sigma	A5955
细胞活力检测	CellTiter-Glo试剂	Promega	G7570
药物处理	多柔比星	LC Labs	D-4000
依维莫司	LC Labs	E-4040
GDC-0941	Selleck Chemicals	S1065
曲美替尼	Selleck Chemicals	S2673
MK-2206	Selleck Chemicals	S1078
PAX7免疫荧光	TSA-Plus花青素5	PerkinElmer	NEL745001KT
荧光素酶报告基因实验	pGL4.25荧光素酶报告载体	Promega	E8431
FuGene转染试剂	Promega	E2692
荧光素酶检测系统	Promega	E1501
LacZ/β-半乳糖苷酶定量试剂盒	ThermoScientific	F-2905
慢病毒转导	Lenti-X浓缩试剂	Takara	631232
RNA提取	miRNeasy小型试剂盒	Qiagen	217004
miRNeasy微量试剂盒	Qiagen	217084
逆转录	Superscript III第一链cDNA合成试剂盒	ThermoFisher	18080055
微阵列分析	Mouse 2.0 ST微阵列芯片	Affymetrix	902118
RNA-seq建库	KAPA Hyper-Prep建库试剂盒	Roche	KK8604
动物实验	基质胶	Corning	354234
VetBond组织粘合剂	3M	14695B
Media 199培养基	Gibco	11150-067
细胞培养	人骨骼肌成肌细胞	Lonza	CC-2580
通用支原体检测试剂盒	ATCC	30-1012K

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

DMEM培养基

HyClone

SH32043

胎牛血清

Hyclone

抗生素/抗真菌剂

Sigma

A5955

细胞活力检测

CellTiter-Glo试剂

Promega

G7570

药物处理

多柔比星

LC Labs

D-4000

依维莫司

LC Labs

E-4040

GDC-0941

Selleck Chemicals

S1065

曲美替尼

Selleck Chemicals

S2673

MK-2206

Selleck Chemicals

S1078

PAX7免疫荧光

TSA-Plus花青素5

PerkinElmer

NEL745001KT

荧光素酶报告基因实验

pGL4.25荧光素酶报告载体

Promega

E8431

FuGene转染试剂

Promega

E2692

荧光素酶检测系统

Promega

E1501

LacZ/β-半乳糖苷酶定量试剂盒

ThermoScientific

F-2905

慢病毒转导

Lenti-X浓缩试剂

Takara

631232

RNA提取

miRNeasy小型试剂盒

Qiagen

217004

miRNeasy微量试剂盒

Qiagen

217084

逆转录

Superscript III第一链cDNA合成试剂盒

ThermoFisher

18080055

微阵列分析

Mouse 2.0 ST微阵列芯片

Affymetrix

902118

RNA-seq建库

KAPA Hyper-Prep建库试剂盒

Roche

KK8604

动物实验

基质胶

Corning

354234

VetBond组织粘合剂

14695B

Media 199培养基

Gibco

11150-067

细胞培养

人骨骼肌成肌细胞

Lonza

CC-2580

通用支原体检测试剂盒

ATCC

30-1012K

环节	核对要点
小鼠基因型与分组	aP2-Cre;SmoM2/+;Ptenflox/flox（ASPcKO）等基因型；P12评估肿瘤质量；生存分析样本量ASPWT n=23、ASPcHet n=42、ASPcKO n=18 阅读提示：Methods 'Genetically engineered mouse models'及Fig. 1b、1c图注
肿瘤组织学与免疫组化	固定方式（新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋）、抗体种类及抗原修复条件；DESMIN、MYOD1、MYOGENIN、Ki67、PTEN染色阅读提示：Methods 'Histology and immunostaining'及Supplementary Tables 1–2
人FN-RMS细胞系与PDX的shRNA敲低	细胞系SMS-CTR、RD、Rh18、SJRHB015721_X1、SJRHB011_Y；两种独立shRNA与scramble对照；转导后检测时间（如5天或8天）阅读提示：Methods 'Molecular cloning, viral transduction, and luciferase assays'及Fig. 6d图注
原位异种移植	每只小鼠注射1×10^6 PDX细胞、100 μL基质胶、腓肠肌注射；SCID/Beige小鼠；肿瘤体积计算公式阅读提示：Methods 'In vivo tumorigenesis'及Fig. 6g–l图注
ChIP-qPCR检测PAX7结合	4 μg PAX7抗体、过夜4°C孵育、Covaris M220超声条件（峰值功率75、占空比15%、每 burst 200循环、7°C、12 min）；引物序列阅读提示：Methods 'Chromatin immunoprecipitation'及Supplementary Table 1
Dbx1启动子荧光素酶实验	280 ng pGL4.25-Dbx1启动子、20 ng pCMV6-LacZ、Pax7剂量递增；FuGene转染；荧光素酶与β-半乳糖苷酶检测阅读提示：Methods 'Molecular cloning, viral transduction, and luciferase assays'及Fig. 5i图注
流式分选与RNA-seq	tdTomato+/CD31−分选策略；每基因型n=4肿瘤；低输入RNA-seq建库（5 ng RNA、KAPA Hyper-Prep、4个PCR循环）阅读提示：Methods 'Fluorescence-activated cell sorting'与'RNA isolation and gene expression analysis'及Fig. 8e图注

环节

核对要点

小鼠基因型与分组

aP2-Cre;SmoM2/+;Ptenflox/flox（ASPcKO）等基因型；P12评估肿瘤质量；生存分析样本量ASPWT n=23、ASPcHet n=42、ASPcKO n=18

阅读提示：Methods 'Genetically engineered mouse models'及Fig. 1b、1c图注

肿瘤组织学与免疫组化

固定方式（新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋）、抗体种类及抗原修复条件；DESMIN、MYOD1、MYOGENIN、Ki67、PTEN染色

阅读提示：Methods 'Histology and immunostaining'及Supplementary Tables 1–2

人FN-RMS细胞系与PDX的shRNA敲低

细胞系SMS-CTR、RD、Rh18、SJRHB015721_X1、SJRHB011_Y；两种独立shRNA与scramble对照；转导后检测时间（如5天或8天）

阅读提示：Methods 'Molecular cloning, viral transduction, and luciferase assays'及Fig. 6d图注

原位异种移植

每只小鼠注射1×10^6 PDX细胞、100 μL基质胶、腓肠肌注射；SCID/Beige小鼠；肿瘤体积计算公式

阅读提示：Methods 'In vivo tumorigenesis'及Fig. 6g–l图注

ChIP-qPCR检测PAX7结合

4 μg PAX7抗体、过夜4°C孵育、Covaris M220超声条件（峰值功率75、占空比15%、每 burst 200循环、7°C、12 min）；引物序列

阅读提示：Methods 'Chromatin immunoprecipitation'及Supplementary Table 1

Dbx1启动子荧光素酶实验

280 ng pGL4.25-Dbx1启动子、20 ng pCMV6-LacZ、Pax7剂量递增；FuGene转染；荧光素酶与β-半乳糖苷酶检测

阅读提示：Methods 'Molecular cloning, viral transduction, and luciferase assays'及Fig. 5i图注

流式分选与RNA-seq

tdTomato+/CD31−分选策略；每基因型n=4肿瘤；低输入RNA-seq建库（5 ng RNA、KAPA Hyper-Prep、4个PCR循环）

阅读提示：Methods 'Fluorescence-activated cell sorting'与'RNA isolation and gene expression analysis'及Fig. 8e图注

大家都在搜

大家都在搜