DLX1表达的临床关联分析
探究DLX1表达与前列腺癌进展和预后的关系
分析TCGA-PRAD、GSE35988等公共数据集及患者组织芯片（TMA）中DLX1表达，并进行生存分析。
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涉及ERG和AR的转录网络协调Distal-less homeobox-1介导的前列腺癌进展
Transcriptional network involving ERG and AR orchestrates Distal-less homeobox-1 mediated prostate cancer progression.
实验完整度
高包含细胞系、患者组织芯片、小鼠异种移植和骨转移模型，以及功能、机制和药物干预验证。
主要模型
22RV1细胞（CRPC，ERG阴性） VCaP细胞（TMPRSS2-ERG融合阳性） RWPE1细胞（良性前列腺上皮细胞） NOD/SCID和裸鼠异种移植及骨转移模型
重点核对
DLX1敲除（22RV1）和过表达（RWPE1）对增殖、迁移、克隆形成和软琼脂生长的影响 ERG/AR/FOXA1在DLX1启动子/增强子的结合（ChIP-qPCR、Re-ChIP）及报告基因活性 R1881（10 nM）刺激和恩杂鲁胺（10 µM）/EPI-001处理对DLX1表达的调控 JQ1（0.5 µM）和恩杂鲁胺（10 µM）单用或联用对DLX1表达及细胞功能的影响 小鼠异种移植中肿瘤生长、转移（Alu序列）及骨破坏（microCT）的评估
摘要
Distal-less homeobox-1 (DLX1) 是前列腺癌 (PCa) 诊断的成熟非侵入性生物标志物，但其在疾病病理生物学中的机制基础尚不清楚。在这里，我们揭示了DLX1的致癌作用，并表明废除其功能会导致肿瘤发生和转移减少。我们观察到约60%的晚期和转移性患者显示DLX1水平较高。此外，约96%的TMPRSS2-ERG融合阳性和约70%的雄激素受体 (AR) 阳性患者显示DLX1升高，与侵袭性疾病和不良生存相关。机制上，ERG与增强子结合的AR和FOXA1协调，在ERG阳性背景中驱动DLX1的转录上调。然而，在ERG阴性背景下，AR/AR-V7和FOXA1足以上调DLX1。值得注意的是，使用BET抑制剂 (BETi) 或/和抗雄激素药物抑制ERG/AR介导的DLX1转录可降低其表达和下游致癌效应。总之，本研究确立了DLX1作为ERG/AR的直接靶标具有致癌作用，并证明了BETi和抗雄激素对DLX1阳性患者的临床意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DLX1在前列腺癌中上调的转录调控机制及其在疾病进展中的功能作用是什么？
- 核心机制
- 在TMPRSS2-ERG融合阳性背景中，ERG与增强子结合的AR和FOXA1协调驱动DLX1转录上调；在ERG阴性背景中，AR/AR-V7和FOXA1足以上调DLX1。DLX1通过直接转录激活ALDH1A1和HNF1A等靶基因促进肿瘤发生和转移。
- 主要证据
- 临床样本分析显示DLX1高表达与侵袭性疾病和不良生存相关；细胞系功能实验表明DLX1调控增殖、迁移、干性和凋亡；ChIP-qPCR和报告基因实验证实ERG/AR/FOXA1对DLX1的直接转录调控；小鼠异种移植和骨转移模型显示DLX1敲除减少肿瘤生长和转移；BET抑制剂和抗雄激素可降低DLX1表达及致癌效应。
- 研究意义
- 确立了DLX1作为ERG/AR的直接靶标具有致癌作用，并提示BET抑制剂和抗雄激素可用于DLX1阳性前列腺癌患者的治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DLX1功能获得和丧失实验
验证DLX1对前列腺癌细胞增殖、迁移、克隆形成和干性的影响
在RWPE1细胞中过表达DLX1，在22RV1细胞中CRISPR/Cas9敲除DLX1，在VCaP细胞中siRNA敲低DLX1，进行增殖、克隆形成、迁移、软琼脂、凋亡、细胞周期和干性标志物检测。
DLX1下游靶基因和通路的鉴定
揭示DLX1介导的致癌作用的分子机制
对22RV1-DLX1-KO和对照细胞进行全基因组表达谱芯片分析，DAVID和GSEA分析；ChIP-qPCR验证DLX1对ALDH1A1和HNF1A启动子的直接结合。
DLX1在体内肿瘤生长和转移中的作用
评估DLX1敲除对小鼠肿瘤生长和自发转移的影响
将22RV1-DLX1-KO和对照细胞皮下植入NOD/SCID小鼠，监测肿瘤体积；通过Alu序列qPCR检测肺和骨髓转移；另通过胫骨髓内注射评估骨转移。
ERG/AR/FOXA1对DLX1的转录调控验证
阐明ERG、AR和FOXA1如何调控DLX1转录
分析公共ChIP-seq数据，进行ChIP-qPCR、Re-ChIP、报告基因实验；用R1881刺激、siRNA敲低ERG/AR/FOXA1、抗雄激素处理，检测DLX1表达。
BET抑制剂和抗雄激素对DLX1的靶向抑制
评估BET抑制剂JQ1单用或联合恩杂鲁胺对DLX1表达及致癌表型的影响
在VCaP、22RV1和42D ENZR细胞中处理JQ1（0.5 µM）和/或恩杂鲁胺（10 µM），检测DLX1表达、细胞增殖、迁移、ALDH活性和前列腺球形成；并在小鼠异种移植模型中验证药物效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco Thermo-Fisher | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco Thermo-Fisher | -- | |
| 角质形成细胞无血清培养基 | ThermoFisher | -- | |
| 支原体检测 | PlasmoTest支原体检测试剂盒 | InvivoGen | -- |
| DLX1敲除 | CRISPR/Cas9敲除试剂盒 | Origene | KN206895 |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 慢病毒包装 | ViraPower慢病毒包装混合物 | Invitrogen | -- |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- | |
| 聚凝胺（溴化己二甲铵） | Sigma-Aldrich | -- | |
| 稳定细胞系筛选 | 遗传霉素 | Gibco, ThermoFisher Scientific | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 细胞增殖实验 | 刃天青 | Cayman Chemicals | -- |
| 迁移实验 | Transwell Boyden小室 | Corning | -- |
| 软琼脂实验 | 低熔点琼脂糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | TRIzol | Ambion | -- |
| cDNA合成 | 第一链cDNA合成试剂盒 | Genetix Biotech Asia Pvt. Ltd | -- |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Genetix Biotech Asia Pvt. Ltd | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物套装II | Calbiochem | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | VWR | -- | |
| PVDF膜 | GE Healthcare | -- | |
| DLX1抗体 | Thermo | PA5-28899 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | 3195 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| 磷酸化Akt抗体 | CST | 13038 | |
| 总Akt抗体 | CST | 9272 | |
| Caspase-3抗体 | CST | 9662 | |
| 切割型PARP抗体 | CST | 9541 | |
| Bcl-xL抗体 | CST | 2764 | |
| ERG抗体 | Abcam | ab92513 | |
| FOXA1抗体 | CST | 58613 | |
| AR抗体 | CST | 5153 | |
| PSA抗体 | CST | 5877 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab6276 | |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-144 | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | BioLegend | 421301 |
| PE Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 559763 | |
| StemPro Accutase细胞解离液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| ALDH活性检测 | Aldefluor试剂盒 | Stem Cell Technologies | 01700 |
| 流式细胞术 | PE/Cy7抗人CD44抗体 | Miltenyi Biotec | 130-113-904 |
| CD338-PE（ABCG2-PE）抗体 | Miltenyi Biotec | 130-105-010 | |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 吡罗昔康 | -- | -- | |
| 药物处理 | 恩杂鲁胺 | -- | -- |
| JQ1 | -- | -- | |
| R1881 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| EPI-001 | -- | -- | |
| 药物配制 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 聚乙二醇400 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 玉米油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 环糊精 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫组化 | Ki-67抗体 | CST | 9449 S |
| ERG [EPR3864]抗体 | Abcam | ab92513 | |
| AR抗体 | CST | 5153 | |
| Ki-67抗体 | Agilent | IR626 | |
| ALDH1A1抗体 | CST | 54135 | |
| EnVision FLEX高pH靶标修复液 | Agilent DAKO | K800421-2 | |
| 1X EnVision FLEX洗涤缓冲液 | Agilent DAKO | K800721-2 | |
| Peroxidazed 1 | Biocare Medical | PX968M | |
| Background Punisher | Biocare Medical | BP974L | |
| Mach2 Doublestain 1 | Biocare Medical | MRCT523L | |
| Ferangi Blue溶液 | Biocare Medical | FB813S | |
| EcoMount封片剂 | Biocare Medical | EM897L | |
| RNA原位杂交 | DLX1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 569601 |
| ChIP | H3K9Ac抗体 | CST | 9649 |
| Rpb1 CTD/RNA PolII抗体 | CST | 2629 | |
| 对照兔IgG | Invitrogen | 10500C | |
| 对照小鼠IgG | Invitrogen | 10400C | |
| 蛋白G包被Dynabeads | Invitrogen | -- | |
| 牛血清白蛋白 | HiMedia | -- | |
| 剪切鲑鱼精DNA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | -- | |
| 报告基因实验 | Dual-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| GloMax 96微孔板发光检测仪 | Promega | -- | |
| 前列腺球形成实验 | B27添加剂 | Invitrogen | -- |
| 表皮生长因子 | Invitrogen | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养与鉴定 | 细胞系来源（ATCC）、培养基补充物（10% FBS、0.5% Penicillin-Streptomycin）、STR鉴定和支原体检测 阅读提示：Methods中“Cell lines culture conditions and authentication”小节 |
| DLX1敲除细胞系建立 | CRISPR/Cas9试剂盒（Origene KN206895）、gRNA序列、嘌呤霉素筛选浓度（1 µg/ml）、单克隆筛选和验证 阅读提示：Methods中“Establishing DLX1 knockout cell line”小节和Supplementary Table 1 |
| 细胞功能实验 | 接种细胞数（增殖1×10^4/孔、克隆形成2×10^3/孔、迁移1×10^5/孔、软琼脂1.5×10^4/孔）、血清浓度、培养时间、重复次数 阅读提示：Methods中“Functional assays”小节 |
| ChIP-qPCR和Re-ChIP | 交联条件、超声片段大小（~500 bp）、抗体用量（4 µg）、引物序列 阅读提示：Methods中“Chromatin immunoprecipitation (ChIP)”小节和Supplementary Table 1 |
| 药物处理（R1881、恩杂鲁胺、JQ1） | R1881浓度（10 nM）和时间点、恩杂鲁胺浓度（10 µM）、JQ1浓度（0.5 µM）、血清饥饿和CSS处理 阅读提示：Methods中“Androgen stimulation and drug treatment”小节 |
| 小鼠异种移植和给药 | 细胞接种数量（皮下2×10^6或3×10^6）、小鼠品系和性别年龄、随机分组（n=6）、给药剂量（JQ1 50 mg/kg，恩杂鲁胺20 mg/kg）和途径、给药周期 阅读提示：Methods中“Mice xenograft study”小节 |