构建Akt亚型依赖的Ba/F3细胞系
建立可用于评估Akt亚型选择性抑制剂的细胞模型。
利用逆转录病毒载体将肉豆蔻酰化的Akt1、Akt2或Akt3转入小鼠Ba/F3细胞，通过western blot确认过表达和下游信号激活。
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解析Akt抑制剂亚型选择性的细胞模型系统
Cellular model system to dissect the isoform-selectivity of Akt inhibitors.
实验完整度
高包含Ba/F3细胞模型、生化激酶活性、蛋白质谱、晶体结构和PANC1细胞验证，具功能与机制验证。
主要模型
Ba/F3 myr-Akt1细胞系 Ba/F3 myr-Akt2细胞系 Ba/F3 myr-Akt3细胞系 PANC1细胞系（含AKT1或AKT2敲除）
重点核对
Ba/F3 myr-Akt1、myr-Akt2、myr-Akt3细胞系的接种密度及CTG发光信号与亲本细胞比较 化合物处理浓度范围（如30 mM至0.1 nM）及处理时间（活力检测至第4天，免疫印迹4小时） HTRF生化IC50与细胞CTG EC50的选择性对数比值（Akt1/Akt2、Akt2/Akt3）比较 CETSA中不同抑制剂浓度（如1 μM、2.5 μM、0.3 μM）及温度梯度处理 PANC1细胞中AKT1/AKT2敲除的sgRNA及验证方法（western blot、qRT-PCR）
摘要
蛋白激酶Akt在细胞过程中发挥关键作用。然而，其各亚型的不同功能迄今尚未阐明，主要原因是缺乏合适的生化和细胞工具。在此背景下，我们开发了一种亚型依赖的Ba/F3模型系统，用于将关于亚型特异性的生化结果转化到细胞水平。我们的细胞模型系统辅以蛋白质X射线晶体学和基于结构的配体设计，产生了具有独特选择性谱的共价变构Akt抑制剂。在首次概念验证中，所开发的分子允许研究癌细胞中Akt抑制的亚型选择性效应。因此，本研究将为阐明Akt亚型在健康和疾病中的选择性作用铺平道路，并促进具有优越靶向特性的下一代治疗药物的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立细胞模型系统以解析Akt抑制剂对Akt1/Akt2/Akt3亚型的选择性，并将生化选择性转化为细胞水平？
- 核心机制
- 共价变构抑制剂与Akt的PH域和激酶域之间的变构口袋中半胱氨酸残基共价结合，稳定自抑制构象，从而实现亚型选择性抑制。
- 主要证据
- 基于Ba/F3 myr-Akt亚型依赖细胞系的活力检测和免疫印迹显示化合物1、14、20的选择性，生化IC50与细胞EC50选择性对数比值一致；PANC1细胞中CETSA和免疫印迹验证14对Akt2、20对Akt2/Akt3的靶向作用。
- 研究意义
- 该Ba/F3细胞模型系统可作为高通量分析步骤，用于从化合物库中筛选有前景的Akt亚型选择性抑制剂，并促进下一代具有优越靶向特性的治疗药物的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Ba/F3 myr-Akt细胞系对Akt抑制剂的敏感性
验证细胞系能否响应Akt抑制并反映亚型选择性。
用borussertib、capivasertib及亚型选择性CAAIs 15a/16b处理细胞，检测细胞活力和Akt信号磷酸化变化。
基于同源模型和结构设计合成共价变构抑制剂
利用Akt亚型变构口袋的结构差异设计亚型选择性抑制剂。
基于Akt1共晶结构（PDB: 6S9X）构建Akt2/Akt3同源模型，设计并合成23个吡啶核心的共价变构抑制剂。
生化活性与动力学表征
测定抑制剂对Akt1/Akt2/Akt3的IC50、Ki、kinact及共价修饰。
采用HTRF激酶活性 assay测定IC50，PhosphoSens®连续荧光法测定动力学参数，蛋白质谱检测共价标记。
Akt1共晶结构解析
阐明抑制剂与Akt1的结合模式及共价修饰位点。
将Akt1选择性吡啶衍生物3和6与全长Akt1共结晶，收集X射线衍射数据并解析结构。
在Ba/F3模型中评估选择性转化
比较生化选择性与细胞水平选择性，验证模型系统的适用性。
用23个CAAIs处理Ba/F3 myr-Akt细胞系，测定CTG EC50，计算选择性对数比值并与HTRF IC50对数比值比较。
在PANC1细胞中验证靶向作用
在更接近天然的癌细胞系中验证抑制剂亚型选择性。
用化合物1、14、20处理PANC1细胞（含AKT1或AKT2敲除），通过免疫印迹和CETSA检测Akt亚型磷酸化及热稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Ba/F3 myr-Akt细胞系构建 | 逆转录病毒载体、嘌呤霉素筛选浓度、IL-3依赖培养条件 阅读提示：Methods中Myr-Akt expression constructs、Generation of the retrovirus、Cell lines小节 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种数、化合物浓度范围、检测时间、重复数 阅读提示：Methods中Cell Viability Assay小节；Fig. 1c、1d和Fig. 4图注 |
| 生化HTRF活性检测 | ATP浓度、底物浓度、反应时间、酶浓度 阅读提示：Methods中Activity-based assay小节 |
| 动力学检测 | ATP浓度、酶浓度、反应缓冲液组成、检测频率 阅读提示：Methods中Kinetic Enzyme Assay小节 |
| CETSA | 化合物浓度、处理时间、温度梯度、细胞数 阅读提示：Methods中Cellular thermal shift assay小节；Fig. 5b和Supplementary Fig. 17 |