建立氨基酸饥饿与谷氨酰胺/亮氨酸回补模型
明确谷氨酰胺和亮氨酸对ATP水平及AMPK活性的影响。
U2OS、HCT116、HEK293A细胞以EBSS（补加4.5 g/L葡萄糖）进行氨基酸饥饿，回补谷氨酰胺（2 mM）、亮氨酸（0.8 mM）或DMKG（2 mM），检测ATP/ADP比值、OCR及AMPK、mTORC1磷酸化。
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谷氨酰胺代谢与mTORC1活性通过两条平行通路连接调控谷氨酰胺凋亡
Two parallel pathways connect glutamine metabolism and mTORC1 activity to regulate glutamoptosis.
实验完整度
高含U2OS、HCT116、MEFs体外模型及HCT116移植瘤小鼠模型，并开展siRNA、过表达及代谢组学机制验证
主要模型
U2OS细胞 HCT116细胞 HEK293A细胞 HCT116移植瘤NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl/SzJ小鼠模型
重点核对
U2OS、HCT116细胞氨基酸饥饿后加入谷氨酰胺（2 mM）或亮氨酸（0.8 mM）处理72 h，检测ATP/ADP比值及mTORC1、AMPK磷酸化 AICAR 0.5 mM、Metformin 5 mM、A769662 100 µM再激活AMPK，检测mTORC1活性、自噬及凋亡 BPTES 29 µM或DON 40 µM抑制GLS，联合ASNS siRNA敲低，检测ATP/ADP比值及AMPK、mTORC1磷酸化 Seahorse XF-24检测OCR，依次注射oligomycin 1 µM、FCCP 2.5 µM、rotenone 1 µM/antimycin A 1 µM HCT116移植瘤小鼠分组（每组10只）腹腔注射DMKG 3 g/kg/week、Temsirolimus 10 g/kg/week、metformin 600 mg/kg/week，检测S6磷酸化及cleaved caspase 3
摘要
谷氨酰胺凋亡（glutamoptosis）是增殖细胞在营养失衡时，因谷氨酰胺分解和mTORC1信号异常激活而诱导的凋亡性细胞死亡。生物能量传感器AMPK在谷氨酰胺凋亡中的作用尚未明确。本研究表明，AMPK再激活可在体外和体内阻断谷氨酰胺依赖的mTORC1激活及谷氨酰胺凋亡。研究还表明，谷氨酰胺用于天冬酰胺合成及GABA旁路以产生ATP并抑制AMPK，且不依赖谷氨酰胺分解。总体而言，结果表明谷氨酰胺代谢通过两条平行通路与mTORC1激活相连：一条急性的α-酮戊二酸依赖通路，以及一条次级的ATP/AMPK依赖通路。谷氨酰胺与mTORC1之间的这种双重代谢连接，在为癌症等疾病设计阻止细胞生长的治疗策略时须加以考虑。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在营养失衡时，谷氨酰胺代谢如何连接ATP/AMPK轴并调控mTORC1激活及谷氨酰胺凋亡。
- 核心机制
- 谷氨酰胺经两条平行通路连接mTORC1：一条为GLS/GDH介导的αKG生成，促进Rag依赖的mTORC1溶酶体转位；另一条为ASNS和GABA旁路产生ATP、抑制AMPK，使mTORC1在溶酶体表面完全激活。
- 主要证据
- 在U2OS、HCT116等细胞中通过ATP/ADP比值、Seahorse OCR、免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术及LC-MS代谢组学和13C/15N示踪验证；并在HCT116移植瘤小鼠中通过IHC检测S6磷酸化和cleaved caspase 3。
- 研究意义
- 研究提出谷氨酰胺与mTORC1的双重代谢连接，应纳入未来针对癌症等疾病阻止细胞生长的治疗策略设计；并提示ASNS与GLS可作为双重抑制靶点以有效抑制癌细胞mTORC1。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证AMPK对mTORC1及谷氨酰胺凋亡的调控
明确AMPK再激活是否阻断谷氨酰胺依赖的mTORC1激活和细胞死亡。
在LQ处理的氨基酸饥饿细胞中加入AICAR、metformin或A769662，或转染组成型激活AMPK突变体，检测mTORC1活性、自噬标志物、细胞活力、克隆形成及annexin V/PI和凋亡标志物。
在移植瘤小鼠中验证谷氨酰胺凋亡及AMPK作用
确认谷氨酰胺凋亡及AMPK抑制在体内对肿瘤细胞死亡的必要性。
HCT116细胞皮下接种于免疫缺陷小鼠右背侧，待肿瘤平均体积达200 mm3后腹腔注射DMKG，并联合temsirolimus或metformin，检测肿瘤S6磷酸化、cleaved caspase 3及AMPK磷酸化。
确定谷氨酰胺产ATP是否依赖谷氨酰胺分解
检验GLS/GDH介导的谷氨酰胺分解对ATP产生和AMPK抑制的必要性。
以BPTES、DON或siRNA抑制GLS，或以siRNA敲低GDH，检测LQ或谷氨酰胺处理后的ATP/ADP比值及AMPK、mTORC1磷酸化。
鉴定谷氨酰胺代谢的替代通路
寻找谷氨酰胺分解之外负责ATP产生的代谢通路。
采用LC-MS代谢组学及[U-13C]-谷氨酰胺、[15N2]-谷氨酰胺示踪，检测代谢物水平；以siRNA敲低ASNS，联合BPTES，检测ATP/ADP比值、AMPK磷酸化及ASNS mRNA表达。
验证GLS与ASNS双抑制对mTORC1的协同作用
检验GLS和ASNS是否作为两条必要分支共同连接谷氨酰胺与mTORC1。
在含全部氨基酸条件下，以BPTES抑制GLS并以siRNA敲低ASNS，检测mTORC1下游S6K、S6、4EBP1磷酸化及AMPK磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D6429 |
| 氨基酸饥饿 | Earle平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | E2888 |
| ATP/ADP比值检测 | 发光法ATP/ADP比值检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK135 |
| TriStar² LB 942微孔板读数仪 | Berthold | -- | |
| 蛋白提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma | P0044, P5726 | |
| 蛋白提取与定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 蛋白转膜 | Trans-Blot Turbo转膜系统 | BioRad | -- |
| 免疫印迹成像 | ChemiDoc MP成像系统 | BioRad | -- |
| 流式分析 | Annexin V早期凋亡检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | 6592 |
| BD FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 逆转录 | GoScript逆转录系统 | Promega | -- |
| 实时PCR | SSO Advanced Universal SYBR Green预混液 | BioRad | -- |
| Step-One Plus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 共聚焦显微镜 | LEICA SP4共聚焦显微镜 | LEICA | -- |
| 共聚焦显微镜封片 | 含DAPI的Prolong封片剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA转染 | INTERFERin siRNA转染试剂 | POLYplus transfection | -- |
| 质粒转染 | Jetpei转染试剂 | Polyplus Transfection | -- |
| 克隆形成实验染色 | 结晶紫 | -- | -- |
| 耗氧率检测 | XFe24细胞培养微孔板 | -- | -- |
| Seahorse XF-24细胞外通量分析仪 | -- | -- | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 代谢组学 | U-13C-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1822-SP-PK |
| U-15N2-谷氨酰胺 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-1328-PK | |
| LC-MS分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Dionex U3000超高效液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Sequant ZIC-pHILIC色谱柱 | Merck Millipore | -- | |
| 免疫组织化学 | 兔抗cleaved caspase-3 Asp175抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| 磷酸化S6核糖体蛋白Ser235/236抗体 | Cell Signaling Technology | 4856 | |
| 磷酸化AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| DAB显色试剂盒 | Vector Lab | SK-4100 | |
| 免疫组织化学成像 | Leica DM6000B显微镜 | Leica | -- |
| Leica DFC500数码相机 | Leica | -- | |
| 钙成像 | Fluo2 LR-AM钙指示剂 | -- | -- |
| IX70倒置落射荧光显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 氨基酸饥饿与谷氨酰胺/亮氨酸回补 | EBSS补加葡萄糖终浓度4.5 g/L；谷氨酰胺2 mM；亮氨酸0.8 mM；处理时间2至72 h 阅读提示：Methods细胞培养小节及Fig. 1、Fig. 4图注 |
| AMPK活性调控 | AICAR 0.5 mM；Metformin 5 mM；A769662 100 µM；处理72 h；CA-AMPK质粒转染 阅读提示：Methods细胞培养与Plasmids小节及Fig. 1、Fig. 2图注 |
| 谷氨酰胺分解抑制 | BPTES 29 µM；DON 40 µM；siRNA转染48 h 阅读提示：Methods细胞培养与siRNA小节及Fig. 3图注 |
| ASNS与GLS双抑制 | ASNS siRNA转染48 h；BPTES处理；含全部氨基酸培养24 h 阅读提示：Methods siRNA小节及Fig. 5H图注 |
| 移植瘤小鼠实验 | 8周龄雄性NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl/SzJ小鼠；每只2×10^6 HCT116细胞皮下接种；每组10只；DMKG 3 g/kg/week；Temsirolimus 10 g/kg/week；Metformin 600 mg/kg/week；治疗3周 阅读提示：Methods Xenograft mouse model小节及Fig. 2J–M图注 |
| 代谢组学与同位素示踪 | U-13C-glutamine（CLM-1822-SP-PK）；U-15N2-glutamine（NLM-1328-PK）；处理72 h；LC-MS色谱与质谱条件 阅读提示：Methods LC–MS for metabolomics analysis小节及Fig. 5图注 |