高通量筛选GPCR内化抑制剂
从大量小分子中鉴定阻断AT1R内体运输的化合物
在HEK293细胞中使用 bystander 内体BRET传感器（RlucII标记AT1R与Endofin-FYVE锚定的rGFP），对约115,000个小分子进行高通量筛选，并以B2R内化进行验证
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从GPCR内吞筛选中发现双重Ras和ARF6抑制剂
Discovery of a dual Ras and ARF6 inhibitor from a GPCR endocytosis screen.
实验完整度
高含高通量筛选、BRET、pull-down、Western blot、分子对接与MD模拟、癌细胞增殖与活力实验
主要模型
HEK293SL细胞 MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞 A549肺癌细胞
重点核对
Rasarfin处理浓度50 μM（部分剂量响应实验使用指示浓度），预处理30 min AT1R内化BRET实验：激动剂AngII 100 nM刺激30 min，n=4独立实验，每实验三复孔 Ras和ARF6活性pull-down实验：AngII 1 μM或EGF 100 ng/ml刺激0和2 min，Rasarfin 50 μM预处理30 min ERK1/2和Akt Western blot：AngII 1 μM、BK 1 μM、Iso 10 μM或EGF 100 ng/ml刺激指示时间，Rasarfin 50 μM或指示浓度预处理30 min 细胞增殖和活力实验：Rasarfin不同浓度或21.4/21.8 10 μM处理96 h（增殖）或指示时间（活力），每实验三复孔重复三次
摘要
G蛋白偶联受体（GPCR）的内化和胞内运输在细胞反应性中起关键作用。受体运输失调可导致异常信号传导和细胞行为。本文利用基于内体BRET的高通量筛选方法，以原型GPCR血管紧张素II 1型受体（AT1R）为对象，从约115,000个小分子库中寻找受体运输抑制剂。我们鉴定出一种新型双重Ras和ARF6抑制剂，命名为Rasarfin，它可阻断激动剂介导的AT1R及其他GPCR的内化。Rasarfin还能强效抑制GPCR诱导的ERK1/2信号传导、EGFR介导的MAPK和Akt信号传导，并阻止癌细胞增殖。计算机模拟和体外研究表明Rasarfin在Ras的SOS结合结构域内具有独特的结合模式。我们的发现揭示了一类用于受体运输和信号传导的双重小G蛋白抑制剂，可用于抑制致癌细胞反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过内体GPCR运输高通量筛选发现同时抑制受体运输和信号传导的小分子，并阐明其作用机制？
- 核心机制
- Rasarfin通过抑制ARF6阻断网格蛋白包被囊泡介导的GPCR内化，并通过结合Ras的SOS结合结构域（switch I与switch II之间）抑制SOS依赖及非依赖的鸟苷酸交换，从而抑制Ras-RAF-MEK-ERK和PI3K/Akt信号。
- 主要证据
- BRET内化筛选（约115,000化合物）鉴定化合物21（Rasarfin）；BRET和pull-down显示其抑制AT1R、B2R、β2AR内化及ARF6和Ras活性；Western blot显示其抑制GPCR和EGFR介导的ERK1/2及Akt磷酸化；分子对接和MD模拟揭示其结合Ras的SOS结合域；MDA-MB-231和A549细胞中抑制增殖。
- 研究意义
- 揭示了一类靶向Ras和ARF6的双重小G蛋白抑制剂，可用于研究受体运输与信号传导的关联，并可能用于抑制致癌细胞反应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
先导化合物21的鉴定与受体内化抑制验证
确认化合物21对多种GPCR内化的抑制效果及对β-arrestin招募和运输的影响
测定21对AT1R、B2R、β2AR内化的IC50，用共聚焦显微镜观察受体和β-arrestin2的定位，用BRET检测β-arrestin招募至受体
确定化合物21靶向ARF6
验证21是否通过抑制ARF6而非直接阻断β-arrestin/AP-2结合来抑制内化
使用β-arrestin2/AP-2 BRET传感器比较21与Barbadin的效果；用GST-GGA3-PBD pull-down和ARF BRET传感器检测ARF6活性；过表达ARF6-WT或ARF6-T27N并检测AT1R从质膜移除
验证化合物21抑制GPCR和RTK介导的信号传导
检测21对ERK1/2和Akt磷酸化的影响并排除直接靶向激酶
用Western blot检测AT1R、B2R、β2AR、EGFR介导的ERK1/2磷酸化及EGFR介导的Akt磷酸化；使用KINOMEscan对384种激酶进行结合筛选；在Gαq/11 KO和β-arrestin1/2 KO细胞中检测21对ERK1/2的影响
确定化合物21靶向Ras
验证21是否直接抑制Ras活性及其鸟苷酸交换
用GST-Raf1-RBD pull-down检测Ras-GTP；用Raf1-RBD-RlucII与rGFP-CAAX BRET传感器检测Ras活化动力学；用纯化H-Ras和mant-GTP在SOS1或EDTA存在下进行体外GEF交换实验；检测21对Rho和Rac/Cdc42活化的影响
分子动力学模拟Rasarfin与Ras的结合模式
在结构层面阐明Rasarfin与Ras的结合位点和稳定性
基于SOS1结合的H-Ras晶体结构（PDB: 1BKD）进行分子对接，将Rasarfin对接至switch I和switch II之间的沟槽；进行总计12 μs的MD模拟（3×4 μs）分析结合稳定性；模拟Rasarfin自发结合（5个分子，3×2 μs）；计算药效团相互作用频率
构效关系研究与功能选择性类似物验证
通过Rasarfin类似物确定关键药效团并验证Cl原子对活性的贡献
测试8个类似物（21.1–21.8）对AT1R内化和ERK1/2活化的影响；用mant-GTP交换实验检测21.4、21.7、21.8对Ras交换活性的影响；对21.4进行MD模拟比较结合稳定性
评估Rasarfin对癌细胞增殖和活力的影响
检测Rasarfin对癌细胞生长和活力的作用
用IncuCyte活细胞成像系统监测MDA-MB-231和A549细胞的汇合度变化；用MTT法检测细胞活力；用pull-down检测MDA-MB-231细胞中Ras和ARF6活性
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白活性和相互作用
验证小G蛋白核苷酸交换
评估激酶选择性
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco, Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| 庆大霉素 | Gibco, Life Technologies | -- | |
| BRET检测 | 腔肠素400a | Nanolight Technology | -- |
| 腔肠素H | Nanolight Technology | -- | |
| Western blot | 磷酸化p44/42 MAPK (ERK1/2) (Thr202/Tyr204) (E10)抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 |
| p44/42 MAPK (ERK1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 磷酸化Akt (Thr308)抗体 | Cell Signaling Technology | 9275 | |
| Akt (pan) (C67E7)抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| Ras抗体 | Cell Signaling Technology | 3965 | |
| RhoA抗体 | Cell Signaling Technology | 2117 | |
| 抗HA过氧化物酶(3F10)抗体 | Sigma Aldrich | 12013819001 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma Aldrich | F7425 | |
| 抗c-Myc (克隆9E10)抗体 | Sigma Aldrich | M4439 | |
| 抗小鼠IgG HRP | BioRad | -- | |
| 抗兔IgG HRP | BioRad | -- | |
| β-actin (C4)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| H-Ras抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-520 | |
| ARF6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7971 | |
| GEF交换实验 | SOS1蛋白（ExD交换结构域，aa564–1049，6xHis标签） | Cytoskeleton Inc. | CS-GE02 |
| Mant-GTP交换缓冲液(2X) | Cytoskeleton Inc. | EB01 | |
| pull-down实验 | 谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B | GE healthcare | -- |
| 细胞处理 | 人血管紧张素II | Sigma Aldrich | -- |
| 缓激肽 | Sigma Aldrich | -- | |
| 表皮生长因子 | Sigma Aldrich | -- | |
| 细胞活力实验 | 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT） | Sigma Aldrich | -- |
| 盐酸多柔比星 | Sigma Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | 多聚-L-鸟氨酸盐酸盐 | Sigma Aldrich | -- |
| 信号通路抑制 | PD184352 | Sigma Aldrich | -- |
| 渥曼青霉素 | Sigma Aldrich | -- | |
| G蛋白抑制 | UBO-QIC | Cedarlane | -- |
| 化合物溶解 | 二甲基亚砜 | BioShop | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高通量筛选用BRET内体运输实验 | 细胞类型（HEK293）、转染质粒量（AT1R-RlucII 0.12 μg，rGFP-FYVE 0.48 μg）、激动剂浓度（AngII 100 nM）、刺激时间（30 min）、BRET检测滤光片（410/80 nm和515/30 nm） 阅读提示：Methods中BRET measurements小节及Fig. 1a图注 |
| 化合物21对受体内化的抑制实验 | 化合物21浓度（50 μM，IC50测定系列浓度）、预处理时间（30 min）、激动剂浓度（AngII 100 nM、BK 1 μM、Iso 10 μM）、细胞（HEK293SL）、重复数（n=4，三复孔） 阅读提示：Methods中BRET measurements及Live-cell imaging小节，Fig. 1d和1e图注 |
| ARF6和Ras活性pull-down实验 | Rasarfin浓度（50 μM）、预处理时间（30 min）、刺激条件（AngII 1 μM或EGF 100 ng/ml，0和2 min）、GST融合蛋白（GST-GGA3-PBD或GST-Raf1-RBD，20 μg）、血清饥饿时间（4 h） 阅读提示：Methods中Glutathione S-transferase (GST) pull-down assays小节，Fig. 2b和Fig. 4a、4b图注 |
| ERK1/2和Akt磷酸化Western blot | Rasarfin浓度（50 μM或指示浓度）、预处理时间（30 min）、激动剂浓度（AngII 1 μM、BK 1 μM、Iso 10 μM、EGF 100 ng/ml）及刺激时间、转染质粒量（Flag-AT1R 3 μg等） 阅读提示：Methods中Western Blot analysis小节，Fig. 3a–d图注 |
| 体外Ras鸟苷酸交换实验 | 纯化H-Ras量（1.66 μg/孔）、SOS1量（0.66 μg/孔）或EDTA浓度（40 mM）、mant-GTP浓度（来自2X缓冲液）、Rasarfin浓度（指示浓度）、检测温度（20 °C）、检测时间（30 min，每30 s读数） 阅读提示：Methods中GTP exchange factor (GEF) assay小节，Fig. 4e、4f及Fig. 8c图注 |
| 癌细胞增殖和活力实验 | 细胞系（MDA-MB-231、A549）、接种密度（1500细胞/孔）、Rasarfin浓度（指示浓度，如5、10 μM）、处理时间（增殖96 h，活力指示时间）、检测方法（IncuCyte汇合度或MTT 590 nm）、重复数（三复孔重复三次） 阅读提示：Methods中Cell proliferation assay和Cell viability assay小节，Supplementary Fig. 12图注 |